本发明专利技术公开了产共轭亚油酸的食品级重组乳酸乳球菌及其构建方法与应用。该构建重组乳酸乳球菌的方法，包括将蛋白质PAI的编码基因导入作为宿主菌的乳酸乳球菌中得到反式-10，顺式-12共轭亚油酸的转化效率高于所述宿主菌的重组乳酸乳球菌的步骤；所述蛋白质PAI为如下a）或b）的蛋白质：a）由SEQ?ID?No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b）将SEQ?ID?No.2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有亚油酸异构酶活性，或具有亚油酸异构酶活性由a）衍生的蛋白质。本发明专利技术的食品级重组乳酸乳球菌能够有效地生产t10c12-CLA，t10c12-CLA的含量占菌体脂肪酸总量的15.19-23.91%。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及产共轭亚油酸的食品级重组乳酸乳球菌及其构建方法与应用。
技术介绍
共轭亚油酸(CLA)属于十八碳二烯酸，是亚油酸(LA)的异构体，包括二十余种组分。其中对顺式_9，反式-11共轭亚油酸和反式-10，顺式-12共轭亚油酸(trans-10，cis-12 ；tl0cl2-CLA)异构体的生物学活性比较清楚。对tl0cl2_CLA来说，它能够促进身体的代谢，抑制脂肪的合成，能减少肥胖症的发生概率。2008年，美国FDA颁发食品许可证，同意将CLA作为食品添加剂使用。目前，CLA已经被许多食品和制药企业作为保健品生产并出售。自然界中，牛、羊体内的一些瘤胃微生物有合成CLA的能力，这些CLA能够进入乳汁中，一升牛奶的CLA总量在1.4克左右，其中tl0cl2-CLA的比重小于10%。工业上，将亚油酸碱性异构化后生成CLA，产物是混合物的形式，除了上述两种CLA组分外，还含有多种异构体杂质，杂质的含量甚至能达到30%以上，这些杂质如果进入人体，容易通过花生四烯酸代谢途径衍生出多种有负面生物学效应的共轭类异构体。可以看出，如果食品中添加的CLA不含有杂质、成分单一的话，更有利于消费者的健康。在生物技术的支撑下，利用微生物大量生产CLA的单一组分，是一个比较理想的途径。研究发现，自然界的一些低等菌类具有自身合成tl0cl2-CLA组分的能力，例如，痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)的亚油酸异构酶 PAI (Propionibacterium acnesisoenzyme)就能够将亚油酸LA异构成tl0cl2_CLA。密码子优化的pai基因，能够在哺乳类细胞中异源表达，也可以将亚油酸转化成tl0cl2-CLA成分(苟克勉，李世丽，亚油酸异构酶在脱氢和异构方面的双重用途，专利申请号:201110112685.5)。但目前还未有tl0cl2_CLA转化效率高的重组食品级微生物的报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的一个技术问题是提供tl0cl2_CLA转化效率高的重组乳酸乳球菌及其构建方法与应用。本专利技术所提供的一株tl0cl2_CLA转化效率高的重组乳酸乳球菌，是乳酸乳球菌(Lactococcus lactis) PA1-75,其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC N0.7148。本专利技术所提供的构建tl0cl2_CLA的转化效率高重组乳酸乳球菌的方法，包括将蛋白质PAI的编码基因导入作为 宿主菌的乳酸乳球菌中得到反式-10，顺式-12共轭亚油酸的转化效率高于所述宿主菌的重组乳酸乳球菌的步骤；所述蛋白质PAI为如下a)或b)的蛋白质:a)由SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将SEQ ID N0.2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有亚油酸异构酶活性，或具有亚油酸异构酶活性由a)衍生的蛋白质。其中，所述蛋白质PAI具有亚油酸异构酶活性。SEQ ID N0.2由424个氨基酸残基组成。上述方法中，所述tl0cl2_CLA的转化效率是指所述宿主菌或重组乳酸乳球菌以亚油酸为底物，培养得到的菌体中的反式-10，顺式-12共轭亚油酸的质量与菌体中反式-10，顺式-12共轭亚油酸和亚油酸质量之和的比值。所述蛋白质PAI的编码基因具体可为如下I)或2)或3)的DNA分子:I)其编码序列是SEQ ID N0.1的DNA分子；2)在严格条件下与I)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质PAI的DNA分子；3)与I)限定的DNA分子具有90%以上的一致性且编码所述蛋白质PAI的DNA分子。其中，SEQ ID N0.1由1275个核苷酸组成，其编码序列是第1-1275位。上述方法中，所述宿主菌为食品级乳酸乳球菌和/或其衍生菌株。所述蛋白质PAI的编码基因通过重组食品级表达载体导入所述宿主菌中。其中，所述食品级乳酸乳球菌是指可食用的乳酸乳球菌，可为乳酸乳球菌NZ3900或其衍生菌株、和/或乳酸乳球菌MG1363或其衍生菌、和/或乳酸乳球菌LM0230或其衍生菌、和/或乳酸乳球菌IL1403或其衍生菌等。所述重组食品级表达载体是筛选标记为食品级筛选标记的表达载体，所述食品级筛选标记具体可为乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的IacF基因。上述方法中，所述食品级乳酸乳球菌可为乳酸乳球菌NZ3900或其衍生菌株、和/或乳酸乳球菌MG1363或其衍生菌、和/或乳酸乳球菌LM0230或其衍生菌、和/或乳酸乳球菌IL1403或其衍生菌等，所述重组食品级表达载体可为表达所述蛋白质PAI的编码基因的重组食品级表达载体。进一步，所述重组食品级表达载体具体可为将所述蛋白质PAI的编码基因插入PNZ8149的多克隆位点得到的重组表达载体。上述任一所述方法构建的反式-10，顺式-12共轭亚油酸的转化效率高于所述宿主菌的重组乳酸乳球菌也属于本专利技术的保护范围。本专利技术还提供了表达所述蛋白质PAI的编码基因的重组食品级表达载体。其中，所述重组食品级表达载体具体可为将所述蛋白质PAI的编码基因插入PNZ8149的多克隆位点得到的重组表达载体。 本专利技术所提供的tl0cl2_CLA转化效率高的重组乳酸乳球菌具体可为食品级乳酸乳球菌，优选为基因工程方法生产的重组型乳酸乳球菌，所述重组乳酸乳球菌整合了外源的亚油酸异构酶PAI基因，该菌株能够表达亚油酸异构酶，该酶能够将亚油酸生物催化成反式-10，顺式-12共轭亚油酸。本专利技术的实验证明，将已申请专利技术专利(苟克勉，李世丽，亚油酸异构酶在脱氢和异构方面的双重用途，专利申请号:201110112685.5)所述的PAI的编码基因，插入食品级表达载体pNZ8149中，然后转化乳酸乳球菌(Lactococcus lactis) NZ3900,进而获得稳定表达PAI基因的食品级重组乳酸乳球菌，能够有效地生产tl0cl2-CLA，产物tl0cl2_CLA的含量占菌体脂肪酸总量的15.19-23.91% ;其中，效果最好的重组菌株中，tl0cl2-CLA含量超过了菌体脂肪酸总量的23.91%，底物亚油酸异构成产物tl0cl2-CLA的转化效率超过了37.6% ;本专利技术为利用重组乳酸乳球菌生产tl0cl2-CLA的相关应用提供了方法和菌株。生物材料信息分类命名:乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)菌株编号:PA1-75保藏机构:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏机构简称:CGMCC地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号保藏日期:2013年01月18日保藏中心登记入册编号:CGMCC N0.7148下面结合具体实施例详细描述本专利技术，这些实施例用于理解而不是限制本专利技术。附图说明图1为各菌株的菌体中亚油酸和反式-10，顺式-12共轭亚油酸占菌体总脂肪酸的百分含量。 具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)NZ3900 (购自德国Mo Bi Tec公司)，是食品级菌株，为乳糖缺陷型菌株，不能本文档来自技高网...
【技术保护点】
重组乳酸乳球菌，其特征在于：所述重组乳酸乳球菌是乳酸乳球菌（Lactococcus?lactis）PAI?75，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC?No.7148。
【技术特征摘要】
1.重组乳酸乳球菌，其特征在于:所述重组乳酸乳球菌是乳酸乳球菌(Lactococcuslactis) PA1-75，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC N0.7148。2.构建重组乳酸乳球菌的方法，包括将蛋白质PAI的编码基因导入作为宿主菌的乳酸乳球菌中得到反式-10，顺式-12共轭亚油酸的转化效率高于所述宿主菌的重组乳酸乳球菌的步骤； 所述蛋白质PAI为如下a)或b)的蛋白质: a)由SEQID N0.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； b)将SEQID N0.2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有亚油酸异构酶活性，或具有亚油酸异构酶活性由a)衍生的蛋白质。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:所述蛋白质PAI的编码基因为如下I)或2)或3)的DNA分子: 1)其编码序列是SEQID N0.1的DNA分子； 2)在严格条件下与I)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质PAI的DNA分子； 3)与I)限定的DNA分 子具有90%以上的一致性且编码所述蛋白质PAI的DNA分子。4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于:所述宿主菌为食品级乳酸乳球菌和/或其衍生菌；...
【专利技术属性】
技术研发人员：苟克勉，李世丽，
申请(专利权)人：苟克勉，
类型：发明
国别省市：
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