本发明专利技术涉及一种携带透明颤菌血红蛋白基因的地衣芽孢杆菌，其特征在于：所述菌株为地衣芽孢杆菌(pHY300-vgb)[Bacillus?licheniformis(pHY300-vgb)]，该菌株保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC?NO：M2011345。本发明专利技术的目的在于提供一种能高产杆菌肽的携带透明颤菌血红蛋白基因的地衣芽孢杆菌的菌株、构建方法及应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种携带透明颤菌血红蛋白基因的地衣芽孢杆菌工程菌株。
技术介绍
杆菌肽为淡黄色或类白色粉末，无嗅，味苦，是由10种氨基酸、12个氨基酸残基构成的多肽类抗生素，可有效抑制革兰氏阳性病原菌和部分革兰氏阴性菌。杆菌肽通过组氨酸的咪唑基和噻唑环，与多种金属离子如Cu2+、Ni2+、Co2+、Zn2+和Mn2+等生成络合物，其中以锌盐形式存在的杆菌肽，抑菌活性得到一定程度的增强，且稳定性最好。杆菌肽拥有在肠道内几乎不吸收，排泄迅速，体内不残留等优点，因此被广泛添加于饲料中。杆菌肽的作用机理是:一、其络合物能吸附在细菌的细胞壁上，阻碍脱磷酸化作用，影响磷脂的运转和向胞壁支架输送粘肽复合物，导致细胞壁合成受到抑制，细胞逐渐死亡；二、结合敏感菌细胞膜脂蛋白中的游离磷酸盐，导致细胞膜损伤，通透性增加，各种离子、氨基酸、嘧啶、嘌呤等外流；三、干扰敏感菌细胞内原浆蛋白的合成。目前,杆菌肽主要生产菌株为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),其通过微生物发酵法生产,微生物发酵过程中，氧气对好氧微生物的生长繁殖和进行能量物质代谢尤为重要，但微生物只能利用溶解在培养基中的氧，从而使氧气供应成为限制发酵产量的一大瓶颈。透明颤菌血红蛋白(Vitreoscilla hemoglobin, VHb)是在革兰氏阴性菌透明颤菌中发现的一种氧调 节蛋白，透明颤菌在限氧条件下大量诱导合成该蛋白，使其在限氧条件下正常生长。VHb能特异性结合O2，并且高速释放，从而促进微生物细胞内氧的传递，提高氧的利用率，这种特性使之能够充分利用有限空间中的氧气。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能高产杆菌肽的携带透明颤菌血红蛋白基因的地衣芽孢杆菌的菌株、构建方法及应用。本专利技术的目的通过如下技术方案实现:一种携带透明颤菌血红蛋白基因的地衣芽孢杆菌，其特征在于:所述菌株为地衣芽孢杆菌(pHY300_vgb) [Bacillus licheniformis (pHY300_vgb)],该菌株保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO:M2011345，保藏日期为2011年10月12曰。一种携带透明颤菌血红蛋白基因的地衣芽孢杆菌的构建方法，其特征在于:质粒pDG1730-vgb+经BamH I和Hind III双酶切得到的1246bp vgb片段，该片段含有芽孢杆菌编码乙酰高丝氨酸内酯(AHL)自身诱导物(Al)合成酶IuxS基因的启动子Pluxs和vgb ORF ；质粒PHY300PLK经BamH I和Hind III双酶切得到4870bp线性质粒片段；1246bp vgb片段与4870bp线性质粒片段经DNA连接酶连接作用，得到表达载体pHY300-vgb ;将表达载体pHY300-vgb转入大肠杆菌进行保存，其后通过电转化转入原始菌株一一地衣芽孢杆菌(B.licheniformis DW2)，以四环素抗性为筛选标记，筛选得到地衣芽孢杆菌(pHY300_Vgb)[Bacillus licheniformis(pHY300_vgb)]。一种携带透明颤菌血红蛋白基因的地衣芽孢杆菌的应用，其特征在于:它在杆菌肽发酵中的应用。较之现有技术而言，本专利技术的优点在于:在地衣芽孢杆菌的表达载体PHY300PLK中连接上透明颤菌血红蛋白基因，构建了一种能在低氧环境下诱导表达透明颤菌血红蛋白，提高宿主菌在低氧发酵环境下的摄氧能力，改善细胞在低氧环境下的生理状态，从而改善了含此基因的宿主菌在发酵中的供氧问题。地衣芽孢杆菌(pHY300-vgb) [Bacilluslicheniformis (pHY300-vgb)]单位菌体杆菌妝产量较原始菌株B.licheniformisDW2提高7 9.4805%。附图说明图1是血红蛋白基因重组载体构建方法示意图。图2为pHY300-vgb的阳性克隆的筛选鉴定图。图3是转化子质粒VHb基因的PCR鉴定图。图4是CO制备装置图。图 5 是 Bacillus licheniformis (pHY300-vgb) > Bacillus licheniformis(pHY300)和 Bacillus l icheniformis DW2 的 CO 差光光谱图。图6是3L罐发酵过程中生物量的变化曲线图。图7是3L罐发酵过程中杆菌肽产量的变化曲线图。具体实施例方式下面结合说明书附图和实施例对本
技术实现思路
进行详细说明:一种携带透明颤菌血红蛋白基因的地衣芽孢杆菌的菌株，其特征在于:所述菌株为地衣芽孢杆菌(pHY300_vgb) [Bacillus licheniformis (pHY300_vgb)],该菌株保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO:M2011345，保藏日期为2011年10月12日。如图1，一种携带透明颤菌血红蛋白基因的地衣芽孢杆菌的构建方法，其特征在于:质粒pDG1730-vgb+经BamH I和Hind III双酶切得到的1246bp vgb片段，该片段含有芽孢杆菌编码乙酰高丝氨酸内酯(AHL)自身诱导物(Al)合成酶IuxS基因的启动子PluxJP vgbORF ;质粒pHY300PLK经BamH I和Hind III双酶切得到4870bp线性质粒片段；1246bp vgb片段与4870bp线性质粒片段经DNA连接酶连接作用，得到表达载体pHY300-vgb ;将表达载体pHY300-vgb转入大肠杆菌进行保存，其后通过电转化转入原始菌株——地衣芽孢杆菌(B.licheniformis DW2)，以四环素抗性为筛选标记，筛选得到地衣芽孢杆菌(pHY300_Vgb)[Bacillus licheniformis(pHY300_vgb)]。所述原始菌株为地衣芽孢杆菌(B.1icheniformi DW2),该菌株保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO:M2011344，保藏日期为2011年10月12日。携带透明颤菌血红蛋白基因的地衣芽孢杆菌的构建方法的具体实施例，如下:(I)质粒pDG1730_vgb+的具体构建方法①质粒pEG49Ι-vgb+经BamHI和HindIII双酶切得到1246bp血红蛋白基因vgb片段；②质粒pDG780经HindIII酶切得到1360bp卡那霉素抗性基因(Kanlr)片断；③两片段插入质粒pDG1730中对应的多克隆位点上，得到质粒pDG1730_vgb+。(2)质粒 pDG1730_vgb+ 的双酶切本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种携带透明颤菌血红蛋白基因的地衣芽孢杆菌，其特征在于：所述菌株为地衣芽孢杆菌(pHY300?vgb)[Bacillus?licheniformis(pHY300?vgb)]，该菌株保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC?NO：M2011345，保藏日期为2011年10月12日。
【技术特征摘要】
1.一种携带透明颤菌血红蛋白基因的地衣芽孢杆菌，其特征在于:所述菌株为地衣芽孢杆菌(pHY300_vgb) [Bacillus licheniformis (pHY300_vgb)],该菌株保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO:M2011345，保藏日期为2011年10月12日。2.—种权利要求1所述携带透明颤菌血红蛋白基因的地衣芽孢杆菌的构建方法，其特征在于:质粒pDG1730-vgb+经BamH I和Hind III双酶切得到的1246bp vgb片段，该片段含有芽孢杆菌编码乙酰高丝氨酸内酯(AHL)自身诱导物(Al)合成酶IuxS基因的启动子Pluxs和vgb ORF ;质粒pHY300PLK经BamH I和Hind III双酶切得到4870bp线性质粒片段；1246bp vgb片段与4870bp线性质粒片段经DNA连接酶连接作用，得到表达载体pHY300-vgb ;将表达载体pHY300-vgb转入大肠杆菌进行保存，其后通过电转化转入原始菌株——地衣芽孢杆菌(B.licheniformis DW2)，以四环素抗性为筛选标记，筛选得到地衣芽抱杆菌(pHY300-vgb) [Bacillus licheniformis (pHY300-vgb)]。3.—种权利要求1或2所述携带透明颤菌血红蛋白基因的地衣芽孢杆菌的应用，其特征在于:它在杆菌肽发酵中的应用。4.根据权利要求3所述携带透明颤菌血红蛋白基因的地衣芽孢杆菌的应用，其特征在于:地衣芽孢杆菌(pHY300-vgb)在杆菌肽发酵中的应用步骤包括:A菌种活化，B种子发酵...
【专利技术属性】
技术研发人员：李俊辉，楼丽君，赖建平，
申请(专利权)人：绿康生化股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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