强化cysP表达的地衣芽胞杆菌及其制备方法和应用技术

本发明专利技术的提供一种强化cysP表达的地衣芽胞杆菌及其制备方法和应用，其中强化cysP表达的地衣芽胞杆菌是通过在地衣芽胞杆菌DW2内转入携带有硫元素转运蛋白基因cysP的质粒载体制得的，实现了地衣芽胞杆菌DW2游离表达硫元素转运蛋白基因cysP，达到强化硫元素转运蛋白基因cysP表达的目的。与直接将不含有

Bacillus licheniformis with enhanced expression of cysp and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
强化cysP表达的地衣芽胞杆菌及其制备方法和应用
本专利技术属于基因工程菌改造
，尤其是一种强化cysP表达的地衣芽胞杆菌及其制备方法和应用。
技术介绍
地衣芽胞杆菌是公认的具有生物安全性(GRAS)的重要工业微生物菌株，其广泛存在于自然界中。鉴于地衣芽胞杆菌具有遗传背景清晰、工业应用价值高等特点，其在近年来被广泛研究。地衣芽胞杆菌属革兰氏阳性菌，其主要用于发酵生产聚γ-谷氨酸、杆菌肽、乙偶姻、2,3-丁二醇、地衣素等多种生物化工产品。杆菌肽是一类由12个氨基酸残基组成的环肽类抗生素，其组成氨基酸包括鸟氨酸(Orn)、D-苯丙氨酸(D-Phe)、异亮组氨酸(His)、D-天冬氨酸(D-Asp)、天冬酰胺(Asn)、赖氨酸(Lys)、D-谷氨酸(D-Glu)、半胱氨酸(Cys)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)和缬氨酸(Val)共11种氨基酸。杆菌肽可以抑制或杀灭某些致病菌，强烈抑制革兰氏阴性菌的生长，并与其它抗生素(如青霉素、庆大霉素等)产生协同增强效应；并且，其几乎不会在动物的肠道内被吸收，而且排泄迅速，没有残留，因此已被广泛应用于饲料添加。目前的研究尚未解析出硫元素转运蛋白CysP在地衣芽孢杆菌中发挥作用的机制以及其是否对杆菌肽前体氨基酸供应造成影响，因此硫元素转运蛋白CysP及其转录基因—cysP基因对地衣芽胞杆菌杆菌肽合成的影响也是不可预知的。地衣芽胞杆菌中存在着众多与菌株代谢产物的合成息息相关的基因，而杆菌肽的产量与何种基因相关仍然是个未知数，通过何种基因改造的方式得到高产杆菌肽的工程菌也有待进一步的研究。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种强化cysP表达的地衣芽胞杆菌的制备方法，此构建方法通过在地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)内游离表达硫元素转运蛋白基因cysP，达到了强化硫元素转运蛋白基因cysP表达的目的。强化cysP表达的地衣芽胞杆菌的构建方法，包括以下步骤：(1)以地衣芽胞杆菌DW2基因组DNA为模板扩增硫元素转运蛋白基因cysP，再在cysP基因片段上游连接启动子、下游连接终止子，构成目的基因片段；(2)准备游离型质粒载体，并根据游离型质粒载体上的酶切位点选择能够对该游离型质粒载体进行双酶切的限制性内切酶，再采用该限制性内切酶分别对该游离型质粒载体和步骤(1)得到的目的基因片段进行双酶切得到线性质粒片段和酶切基因片段；(3)将步骤(2)得到的酶切基因片段和线性质粒片段经DNA连接酶进行连接，得到游离表达载体；(4)将步骤(3)得到的游离表达载体转入至地衣芽胞杆菌DW2中，并筛选得到阳性转化子，即为强化cysP表达的地衣芽胞杆菌；其中，所述的地衣芽胞杆菌DW2(BacilluslicheniformisDW2)已于2011年10月12日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2011344；所述地衣芽胞杆菌DW2的基因组DNA序列中的cysP基因如SEQUENCELISTING中所示。本专利技术人首次尝试构建强化cysP基因表达的地衣芽胞杆菌，通过将携带有cysP基因的质粒载体转入地衣芽胞杆菌DW2中，成功得到了强化cysP基因表达的地衣芽胞杆菌。与直接将不含有cysP基因的空白质粒载体转入地衣芽孢杆菌DW2中得到的菌株相比，通过本专利技术构建得到的强化cysP表达的地衣芽胞杆菌的杆菌肽产量提高了13％以上。本专利技术的研究结果表明：强化表达硫元素转运蛋白基因cysP是一种十分有效的提高地衣芽胞杆菌杆菌肽产量的方法，为提高杆菌肽产量提供了一种新策略。优选的，步骤(2)中的游离型质粒载体选用pHY300PLK，步骤(4)中将游离表达载体转入至地衣芽胞杆菌DW2后，在30-37℃的条件下经含有四环素抗性的培养基进行筛选转化子，得到的强化cysP表达的地衣芽胞杆菌菌株DW2/pHY-cysP。相对于pHT01、pHT43等来说，pHY300PLK拷贝数更高，是组成型表达，表达效果更好；当选用pHY300PLK时，通过对该质粒载体的基因组进行分析可知：其上存在EocRI和XbaI限制性内切酶的酶切位点，进而确定双酶切步骤采用EocRI和XbaI限制性内切酶。在具体实施过程中，根据质粒载体的基因序列中含有EocRI和XbaI限制性内切酶的酶切位点，步骤(2)中采用EocRI和XbaI限制性内切酶对游离型质粒载体和目的基因片段进行双酶切。优选的，步骤(1)中启动子选用P43启动子，P43启动子是芽胞杆菌通用的强启动子，普适性较强。在具体实施过程中，所述P43启动子通常通过以枯草芽胞杆菌基因组为模板经PCR扩增得到。优选的，步骤(1)中终止子选用淀粉酶终止子，淀粉酶终止子为菌种基因改造领域比较通用的终止子。进一步的，所述淀粉酶终止子采用以地衣芽胞杆菌DW2基因组为模板经PCR扩增得到的淀粉酶终止子，此时无需另行购买淀粉酶终止子的来源菌株。本专利技术的目的之二在于提供一种强化cysP表达的地衣芽胞杆菌，其是根据上述的强化cysP表达的地衣芽胞杆菌的构建方法构建得到的。进一步的，所述的强化cysP表达的地衣芽胞杆菌为DW2/pHY-cysP。本专利技术的目的之三在于提供上述强化cysP表达的地衣芽胞杆菌在杆菌肽生产中的应用，所述强化cysP表达的地衣芽胞杆菌是根据上述的强化cysP表达的地衣芽胞杆菌的构建方法构建得到的。进一步的，所述应用步骤包括：A种子发酵，B生产发酵，其中种子发酵的培养基配方为：8-10g/L蛋白胨，3-6g/L酵母浸出粉，7-10g/L氯化钠，pH7.0～7.2；生产发酵的培养基配方为：80-100g/L豆粕；15-40g/L玉米淀粉；4-8g/LCaCO3和0.5-2g/L(NH4)2SO4。附图说明图1为实施例1～14的步骤(1)中得到的P43启动子，硫元素转运蛋白基因cysP和淀粉酶终止子；其中，泳道M为DNAmarker，泳道1为P43启动子，泳道2为硫元素转运蛋白基因cysP，泳道3为淀粉酶终止子；图2为实施例1～14的步骤(1)中得到的目的基因片段的琼脂糖凝胶图；其中，泳道M为DNAmarker，泳道1为目的基因片段；图3为实施例1～14的步骤(3)中得到的游离表达载体pHY-cysP进行菌落PCR验证图；其中，泳道M为DNAmarker，泳道1为游离表达载体pHY-cysP；图4为实施例1～14的步骤(4)中得到的阳性转化子的菌落PCR验证图；其中，泳道M为DNAmarker，泳道1为阳性转化子；其中，上述DNAmarker泳道中从上到下的条带对应的分子量依次为：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。具体实施方式现根据附图具体阐述本专利技术的实施方式：强化cysP表达的地衣芽胞杆菌的构建方法的具体实施方式如下：1、步骤(1)的具体操作步骤为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.强化cysP表达的地衣芽胞杆菌的构建方法，包括以下步骤：/n（1）以地衣芽胞杆菌DW2基因组DNA为模板扩增硫元素转运蛋白基因cysP，再在cysP基因片段上游连接启动子、下游连接终止子，构成目的基因片段；/n（2）准备游离型质粒载体，并根据游离型质粒载体上的酶切位点选择能够对该游离型质粒载体进行双酶切的限制性内切酶，再采用该限制性内切酶分别对该游离型质粒载体和步骤（1）得到的目的基因片段进行双酶切得到线性质粒片段和酶切基因片段；/n（3）将步骤（2）得到的酶切基因片段和线性质粒片段经 DNA连接酶进行连接，得到游离表达载体；/n（4）将步骤（3）得到的游离表达载体转入至地衣芽胞杆菌DW2中，并筛选得到阳性转化子，即为强化cysP表达的地衣芽胞杆菌；/n其中，所述的地衣芽胞杆菌DW2已于2011年10月12日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2011344；/n所述地衣芽胞杆菌DW2的基因组DNA序列中的cysP基因如SEQUENCE LISTING中所示。/n

【技术特征摘要】
1.强化cysP表达的地衣芽胞杆菌的构建方法，包括以下步骤：
（1）以地衣芽胞杆菌DW2基因组DNA为模板扩增硫元素转运蛋白基因cysP，再在cysP基因片段上游连接启动子、下游连接终止子，构成目的基因片段；
（2）准备游离型质粒载体，并根据游离型质粒载体上的酶切位点选择能够对该游离型质粒载体进行双酶切的限制性内切酶，再采用该限制性内切酶分别对该游离型质粒载体和步骤（1）得到的目的基因片段进行双酶切得到线性质粒片段和酶切基因片段；
（3）将步骤（2）得到的酶切基因片段和线性质粒片段经DNA连接酶进行连接，得到游离表达载体；
（4）将步骤（3）得到的游离表达载体转入至地衣芽胞杆菌DW2中，并筛选得到阳性转化子，即为强化cysP表达的地衣芽胞杆菌；
其中，所述的地衣芽胞杆菌DW2已于2011年10月12日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2011344；
所述地衣芽胞杆菌DW2的基因组DNA序列中的cysP基因如SEQUENCELISTING中所示。


2.根据权利要求1所述的强化cysP表达的地衣芽胞杆菌的构建方法，其特征在于：步骤（2）中的游离型质粒载体选用pHY300PLK，步骤（4）中将游离表达载体转入至地衣芽胞杆菌DW2后，在30-37℃的条件下经含有四环素抗性的培养基进行筛选转化子，得到的强化cysP表达的地衣芽胞杆菌菌株DW2/pHY-cysP。


3.根据权利要求2所述的强化cysP表达的地衣芽胞杆菌的构建方法，其特征在于：步骤（2）中采用EocRI和XbaI限制...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈守文，蔡冬波，李凌峰，吴非，李俊辉，陈晓斌，季潇炜，楼丽君，邱湘琪，
申请(专利权)人：绿康生化股份有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35