【技术实现步骤摘要】
强化ppc表达的地衣芽胞杆菌及制备方法和应用
本专利技术属于基因工程菌改造
，尤其是一种强化磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因ppc表达的地衣芽胞杆菌及制备方法和应用。
技术介绍
杆菌肽是一类由12个氨基酸残基组成的环肽类抗生素，其组成氨基酸包括鸟氨酸（Orn），D-苯丙氨酸（D-Phe），异亮组氨酸（His）,D-天冬氨酸（D-Asp）,天冬酰胺（Asn）、赖氨酸（Lys）,D-谷氨酸（D-Glu），半胱氨酸（Cys），亮氨酸（Leu），异亮氨酸（Ile）和缬氨酸（Val）11种氨基酸。杆菌肽又名枯草菌素，其可以抑制或杀灭某些致病菌，有效抑制革兰氏阳性菌如梭状芽胞杆菌属的生长，并与其它抗生素（如青霉素、庆大霉素等）具有协同增强效应；另外，杆菌肽几乎不会在动物的肠道内被吸收，而且排泄较迅速，没有残留，因此被广泛应用于饲料添加。PpC为一种磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，其在生物体的中心碳代谢中发挥着作用，然而，目前的研究并没有解析出PpC的具体功能。并且，地衣芽胞杆菌自身并无PpC的转录基因—ppc基因。因此，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶...
【技术保护点】
1.强化
【技术特征摘要】
1.强化ppc表达的地衣芽胞杆菌的构建方法，包括以下步骤：
（1）以谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组为模板，PCR扩增出ppc基因片段，再在ppc基因片段上游连接启动子、下游连接终止子，构成完整的ppc表达元件；
（2）同时，以地衣芽胞杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出ppc基因插入位点的上游同源臂和下游同源臂；
（3）将插入位点的上游同源臂、ppc表达元件和插入位点的下游同源臂连接到一起，构成目的基因片段，该目的基因片段的排列顺序为：插入位点的上游同源臂-ppc表达元件-插入位点的下游同源臂；
（4）准备整合型质粒载体，并根据整合型质粒载体上的酶切位点选择能够对该整合型质粒载体进行双酶切的限制性内切酶，再采用该限制性内切酶分别对整合型质粒载体和步骤（3）得到的目的基因片段进行双酶切得到线性质粒片段和酶切基因片段；
（5）将步骤（4）得到的酶切基因片段和线性质粒片段经DNA连接酶进行连接，得到整合质粒；
（6）将步骤（5）得到的整合质粒转入地衣芽胞杆菌DW2中，并采用含有筛选标记的培养基进行筛选得到阳性转化子，并对阳性转化子抽质粒进行菌落PCR验证，将验证成功的阳性转化子进行转接培养数次后再次进行菌落PCR检测，得到插入位点的上游同源臂或插入位点的下游同源臂与地衣芽胞杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；
（7）挑选插入位点的上游同源臂与地衣芽胞杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株与插入位点的下游同源臂与地衣芽胞杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株混合接种于30~37℃、不含有筛选标记的培养基中经过数次转接培养，再经PCR法筛选得到整合了ppc基因的地衣芽胞杆菌DW2-ppc；
其中，所述的地衣芽胞杆菌DW2已于2011年10月12日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2011344；
所述谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组中的ppc基因序列如SEQUENCELISTING中所示。
2.根据权利要...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈守文，蔡冬波，吴非，杨帆，李俊辉，陈晓斌，季潇炜，楼丽君，邱湘琪，
申请(专利权)人：绿康生化股份有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35
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