一种具有桧烯高耐受能力的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种具有桧烯高耐受能力的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。该基因工程菌是以大肠杆菌为宿主细胞，在大肠杆菌中过表达不饱和脂肪酸合成酶基因fabA和不饱和脂肪酸合成酶基因fabB。本发明专利技术还提供了该大肠杆菌基因工程菌的构建方法和其在构建产桧烯基因工程菌和发酵生产桧烯中的应用。本发明专利技术不仅在一定程度上能够解决当前大肠杆菌对桧烯耐受性差的问题，打破了桧烯的积累对菌体生长造成的限制，而且为提升桧烯产量提供了新的思路，新的方法。

A high tolerance Escherichia coli gene engineering strain with sabinene and its construction method and Application

【技术实现步骤摘要】
一种具有桧烯高耐受能力的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法与应用
本专利技术涉及一种具有桧烯高耐受能力的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法与应用，属于基因工程

技术介绍
桧烯是一种重要的化工原料，可作为先进生物燃料前体、制备调味品、香水添加剂、精细化学品和药物等。桧烯作为双环萜烯，密度达到0.89g/mL，而以链烷烃为主的航空煤油密度为0.78g/mL，而含大量环烷烃的火箭煤油密度则增加至0.83g/mL。飞行器的性能，例如航程、航速和载荷等，在很大程度上取决于燃料燃烧所释放的热量。因此，提高燃料的能量(或体积热值)是低成本提高航天航空飞行器的推进性能的重要方式。已知生产桧烯的方法主要是通过自然界植物精油的萃取，但这些方法需要高温、高压和复杂的贵重金属催化剂才能实现，不仅投资大、分离提纯困难，还会造成严重的环境污染。微生物合成是一种很有前途的合成桧烯的途径。在目前的研究中，研究人员已能指出桧烯的一般合成途径。桧烯是由异戊二烯单元合成的。该途径的关键中间体是两种常见的C5前体，异戊烯基焦磷酸(IPP)及其异构体二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)。IPP和DMAPP可由甲羟戊酸(MVA)途径或甲基赤藓糖醇-4-磷酸(MEP)途径产生。这种C5骨架将会合成C10的牻牛儿基二磷酸(GPP)，而GPP是桧烯合成的直接前体。在使用葡萄糖作为一般碳源的桧烯代谢途径中是重要的中间产物。目前，两相发酵可用于通过从培养物中捕获产物来减轻桧烯对微生物的毒性。但是现在尚无成熟的桧烯工业发酵的技术，而且在实际发酵过程中，细胞生长受到底物和多种产物的协同抑制作用，这些方法并不能从根本上解决多种产物积累对细胞的毒害作用和对桧烯生产所带来的巨大负面影响。J.D.Keasling等人在工程大肠杆菌中异源表达了43个有机溶剂泵出蛋白，发现该类蛋白能够提高工程大肠杆菌对绝大多数有机溶剂的耐受性。甘油磷酸相关转运相关蛋白glpC的过表达也能够提高大肠杆菌对有机溶剂的耐受性。尽管上述工作都对大肠杆菌的有机溶剂耐受性有较大帮助，但没有从根本上解决微生物对有机溶剂耐受性的难题。综上，如何打破桧烯的积累对菌体生长造成的限制，解决当前大肠杆菌对桧烯耐受性差的问题以及如何解决桧烯产量低的问题是亟待解决的。
技术实现思路
为解决现有大肠杆菌对于桧烯的耐受性差的问题，本专利技术提供了一种具有桧烯高耐受能力的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法与应用，采用的技术方案如下：本专利技术的目的在于提供一种具有桧烯高耐受能力的大肠杆菌基因工程菌，该基因工程菌以大肠杆菌为宿主细胞，在大肠杆菌中过表达不饱和脂肪酸合成酶基因fabA和不饱和脂肪酸合成酶基因fabB；其中：所述不饱和脂肪酸合成酶基因fabA的GenBank序列登录号为ABJ00363.1；所述不饱和脂肪酸合成酶基因fabB的GenBank序列登录号为AVJ11102.1。优选地，所述大肠杆菌为E.coliBL21(DE3)。本专利技术提供了一种上述具有桧烯高耐受能力的大肠杆菌基因工程菌的构建方法，该构建方法包括如下步骤：1)构建含有不饱和脂肪酸合成酶基因fabA的重组质粒；2)构建含有不饱和脂肪酸合成酶基因fabB的重组质粒；3)构建同时含有不饱和脂肪酸合成酶基因fabA和不饱和脂肪酸合成酶基因fabB的重组质粒；4)将步骤1至步骤3获得的三个重组质粒导入大肠杆菌中，得到具有桧烯高耐受能力的大肠杆菌基因工程菌。优选地，包括如下步骤：1)将不饱和脂肪酸合成酶基因fabA连接到质粒pTrcHis-2B上，得到重组质粒pHB1；2)将不饱和脂肪酸合成酶基因fabB连接到质粒pTrcHis-2B上，得到重组质粒pHB2；3)将不饱和脂肪酸合成酶基因fabB连接到重组质粒pHB1上或不饱和脂肪酸合成酶基因fabA连接到将重组质粒pHB2上，得到重组质粒pHB3；4)将重组质粒pHB1、重组质粒pHB2和重组质粒pHB3导入E.coliBL21(DE3)中，得到具有桧烯高耐受能力的大肠杆菌基因工程菌。更优选地，所述构建方法包括如下步骤：1)从大肠杆菌中扩增获得不饱和脂肪酸合成酶基因fabA，对该片段进行BamHI酶和HindIII酶双酶切处理，并将质粒pTrcHis-2B进行同样的双酶切处理，然后用T4连接酶连接，得到重组质粒pHB1；2)从大肠杆菌中扩增获得不饱和脂肪酸合成酶基因fabB，对该片段进行BamHI酶和KpnI酶双酶切处理，并将质粒pTrcHis-2B进行同样的双酶切处理，然后用T4连接酶连接，得到重组质粒pHB2；3)将重组质粒pHB1和不饱和脂肪酸合成酶基因fabB进行XbaI和SalI双酶切处理，然后用T4连接酶连接，或者是将重组质粒pHB2和不饱和脂肪酸合成酶基因fabA进行BamHI酶和KpnI酶双酶切处理，然后用T4连接酶连接，可得到重组质粒pHB3；4)将重组质粒pHB1、重组质粒pHB2和重组质粒pHB3导入E.coliBL21(DE3)中，得到具有桧烯高耐受能力的大肠杆菌基因工程菌。优选地，步骤1)所述扩增所用的引物对如SEQIDNO.1-2所示。优选地，步骤2)所述扩增所用的引物对如SEQIDNO.3-4所示。本专利技术还提供了上述具有桧烯高耐受能力的大肠杆菌基因工程菌在构建产桧烯基因工程菌中的应用。本专利技术还提供了上述具有桧烯高耐受能力的大肠杆菌基因工程菌在发酵生产桧烯中的应用。在本专利技术所述的重组大肠杆菌构建方法中，相关质粒的构建以及感受态细胞的转化方法不受限制，可以采用本领域中已知的常规方法，即利用热激转化法将单个或两个重组质粒转移大肠杆菌感受态细胞中，采用抗生素筛选平板对阳性转化子进行筛选。本专利技术有益效果：有机溶剂与宿主细胞接触后，有机溶剂首先进入细胞膜，以细胞膜的磷脂双分子层结构为有机溶剂毒性作用的主要靶点，结合在细胞膜的磷脂双分子层上，对细胞开始起毒害作用。本专利技术首次以通过调节细胞膜组分的方式来增加大肠杆菌对桧烯的耐受性，具体是通过在大肠杆菌中过表达来自于大肠杆菌的内源基因不饱和脂肪酸合成酶基因fabA、fabB，过表达该两种基因可以使得细胞膜组分由饱和脂肪酸占多数转向不饱和脂肪酸比例增加，进而实现对大肠杆菌细胞膜组分调节，使得大肠杆菌细胞膜中的不饱和脂肪酸的含量得到提升、改变了细胞膜的脂肪酸比例分配，这种分子特性可以使得细胞膜变柔，韧性增加，使得大肠杆菌对桧烯的耐受性得到了明显提升，解决了当前大肠杆菌对桧烯耐受性差的问题。本专利技术构建的大肠杆菌基因工程菌可耐受最高3g/L的桧烯，并且在2g/L和3g/L桧烯胁迫的条件下，对比野生型提高了3倍以上，打破了桧烯的积累对菌体生长造成的限制，为提升桧烯产量提供了新的思路，新的方法。使用本专利技术名改造后的大肠杆菌基因工程菌生产桧烯可以使得桧烯产量得到提升，在过表达两种细胞膜脂肪酸调节基因后，利用MEP和MEP+MVA途径的产量都有所提升，达到了原产量的200％左右。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有桧烯高耐受能力的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌为宿主细胞，在大肠杆菌中过表达不饱和脂肪酸合成酶基因fabA和不饱和脂肪酸合成酶基因fabB；其中：所述不饱和脂肪酸合成酶基因fabA的GenBank序列登录号为ABJ00363.1；所述不饱和脂肪酸合成酶基因fabB的GenBank序列登录号为AVJ11102.1。/n

【技术特征摘要】
1.一种具有桧烯高耐受能力的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌为宿主细胞，在大肠杆菌中过表达不饱和脂肪酸合成酶基因fabA和不饱和脂肪酸合成酶基因fabB；其中：所述不饱和脂肪酸合成酶基因fabA的GenBank序列登录号为ABJ00363.1；所述不饱和脂肪酸合成酶基因fabB的GenBank序列登录号为AVJ11102.1。


2.根据权利要求1所述的具有桧烯高耐受能力的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌为E.coliBL21(DE3)。


3.一种如权利要求1所述的具有桧烯高耐受能力的大肠杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)构建含有不饱和脂肪酸合成酶基因fabA的重组质粒；
2)构建含有不饱和脂肪酸合成酶基因fabB的重组质粒；
3)构建同时含有不饱和脂肪酸合成酶基因fabA和不饱和脂肪酸合成酶基因fabB的重组质粒；
4)将步骤1至步骤3获得的三个重组质粒导入大肠杆菌中，得到具有桧烯高耐受能力的大肠杆菌基因工程菌。


4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将不饱和脂肪酸合成酶基因fabA连接到质粒pTrcHis-2B上，得到重组质粒pHB1；
2)将不饱和脂肪酸合成酶基因fabB连接到质粒pTrcHis-2B上，得到重组质粒pHB2；
3)将不饱和脂肪酸合成酶基因fabB连接到重组质粒pHB1上或不饱和脂肪酸合成酶基因fabA连接到将重组质粒pHB2上，得到重组质粒pHB3；
4)将重组质粒pHB1、重组质粒pHB2和重组质粒pHB3导入E.coliB...

【专利技术属性】
技术研发人员：咸漠，吴桐，张海波，张鸽，李兴，王帆，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37