一种解淀粉芽孢杆菌菌株及其应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程和微生物工程改造技术领域，具体提供了一种高产中性蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌突变菌株及其应用。所述突变菌的保藏编号为CCTCC NO:M2018835。所述突变菌株能高效表达中性蛋白酶，摇瓶发酵酶活高达9514 u/ml，比出发菌提高的68%，20L罐发酵酶活高达40550 U/mL，比出发菌株提高了59%，取得了意料不到的技术效果。所述突变菌株可广泛应用于中性蛋白酶的发酵生产，有利于降低该酶的生产成本，促进中性蛋白酶的推广与应用。

A strain of Bacillus amylolyticus and its application

【技术实现步骤摘要】
一种解淀粉芽孢杆菌菌株及其应用
本专利技术涉及基因工程与微生物改造
，具体涉及一种解淀粉芽孢杆菌及其在中性蛋白酶生产中的应用。
技术介绍
中性蛋白酶（Neutralprotease）是一类在中性pH条件下作用于蛋白质肽键的蛋白酶，可将蛋白质水解成氨基酸、多肽以及游离氨基酸。中性蛋白酶的最适pH在7.0左右，并在pH6.0~9.0之间保持稳定，一般分子量在35~40kDa之间，活性中心为金属离子。中性蛋白酶主要生产菌株有枯草芽孢杆菌（B.subtilis）、米曲霉（A.oryzae）、毛霉（Mucoraceae）、栖土曲霉（Aspergillusterricola）、热介蛋白芽孢杆菌（B.thermoprotyolyticus）、厌色链霉菌（St.griseus）和蜂蜜曲霉（A.melleus）等。中性蛋白酶主要的应用市场为啤酒酿造及水产饲料。众所周知，麦芽是啤酒酿造中最为重要的原料，其质量对于啤酒的品质有着较大的影响，但由于一些国产大麦芽溶解性较差，导致糖化过程中蛋白分解不完全、α-氨基氮不足，会降低啤酒的风味；同时，大量蛋白质的存在会与多酚类物质结合，造成麦汁浑浊，最终导致啤酒在质量上的缺陷。微生物产生的中性蛋白酶与植物蛋白酶相比，不仅能够水解大分子蛋白质，而且可不受植物蛋白酶抑制剂影响，在麦芽糖化过程中加入，可明显改善上述问题。与畜禽动物所不同的是水产动物的肠道pH趋于中性，因而在水产动物饲料中添加的是中性蛋白酶，可以提高水产动物的消化能力，促进其对营养物质的利用，且降低氨氮排泄。此外，中性蛋白酶还可应用于洗涤剂、酿酒酿造以及制革和医药等行业。我国从上个世纪五十年代即开始了中性蛋白酶的研究，选育出一批优良菌株，如枯草芽孢杆菌AS1.398、栖土曲霉3.942等。至二十世纪八九十年代，在菌株诱变筛选、发酵工艺、分离纯化等方向做了大量工作。到二十一世纪初期，开始利用基因手段研究中性蛋白酶的性能和工业应用价值。目前市场上所用的中性蛋白酶大部分来源于芽孢杆菌属（Bacillus），但现有的中性蛋白酶生产菌种的产酶能力普遍偏低，导致中性蛋白酶的生产成本过高，严重限制了该酶在食品、饲料等领域的广泛应用。
技术实现思路
本专利技术为解决现有技术问题，提供了一种解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）突变菌株及其在中性蛋白酶生产中的应用。申请人通过紫外诱变的方法筛选获得的突变菌株，能大幅提高中性蛋白酶的表达量，可广泛应用于中性蛋白酶的生产，降低该酶的成本，促进其广泛应用。本专利技术一方面提供了一种解淀粉芽孢杆菌工程菌株，其携带有表达中性蛋白酶的重组质粒。所述中性蛋白酶的编码核苷酸序列为SEQIDNO:1。本专利技术一方面提供了一种突变菌株解淀粉芽孢杆菌SNP（BacillusamyloliquefaciensSNP），已于2018年11月28日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2018835。本专利技术一方面提供了所述解淀粉芽孢杆菌在生产中性蛋白酶中的应用。本专利技术还提供了一种生产中性蛋白酶的方法，是以所述解淀粉芽孢杆菌为发酵菌株。本专利技术还提供了一种中性蛋白酶，是由所述解淀粉芽孢杆菌发酵获得的。本专利技术首先构建得到高效重组表达中性蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌SAP-2，然后以该菌株为出发菌株，通过紫外诱变方法筛选获得突变菌株解淀粉芽孢杆菌SNP。所述突变菌株摇瓶发酵酶活高达9514U/ml，比出发菌提高的68%，20L罐发酵酶活高达40550U/ml，比出发菌株提高了59%，取得了意料不到的技术效果。所述突变菌产的蛋白酶最适作用温度为50℃，最适作用pH值为7.5，与出发菌株一致。但是，突变菌产的蛋白酶在pH7.0-8.0范围内的相对酶活普遍高于85%，比出发菌更适合在中性条件下发挥作用。本专利技术提供的突变菌株解淀粉芽孢杆菌SNP可广泛应用于中性蛋白酶的发酵生产，有利于降低该酶的生产成本，促进中性蛋白酶的推广与应用。附图说明图1为重组表达质粒pUB110-nprE的质粒图谱。具体实施方式下面结合实例对本专利技术的方法做进一步说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，可按常规条件，如J.萨姆布鲁克（Sambrook）等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本专利技术。但是，实现本专利技术的方法不应限于本专利技术实施例所记载的具体方法步骤。对于本专利技术所涉及的术语及相关测定方法解释如下：1、蛋白酶酶活测定方法：采用中华人民共和国国家标准蛋白酶制剂测定方法（GB/T25327-2009）.2、酶活单位的定义：1g固体酶粉（或1mL液体酶），在一定温度和pH条件下，1min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸，即为1个酶活力单位，以U/g（U/mL）表示。3、运用福林法进行蛋白酶活力测定，使用到的溶液包括：福林使用溶液（一份市售福林溶液与两份水混合，摇匀），碳酸钠溶液（42.4g/L），三氯乙酸（65.4g/L），梯度pH值缓冲液，酪蛋白溶液（10.0g/L）。反应过程如下：试管中加入1mL酶液，40℃温浴2min，加入酪蛋白溶液1mL，摇匀后40℃温浴10min，加入2mL三氯乙酸溶液，摇匀（空白对照先加入三氯乙酸，再加入酪蛋白溶液）。取出静止10min，慢性定性滤纸过滤。取1mL滤液，加碳酸钠溶液5mL，加福林试剂使用溶液1mL，40℃显色20min，于680nm波长，用10mm比色皿测定吸光度。下面结合具体实施方式对本专利技术进行详细描述。实施例1中性蛋白酶基因的筛选与克隆1、解淀粉芽孢杆菌SAP染色体的提取挑取新鲜的野生型解淀粉芽孢杆菌SAP（专利技术人齐建于2015年10月筛选分离自青岛市崂山区林场土壤）单菌落于5mLLB液体培养基中，37℃摇床200rpm振荡培养过夜，按照Tiangen细菌基因组提取试剂盒（天根生化科技有限公司）的说明提取解淀粉芽孢杆菌SAP的染色体。2、中性蛋白酶基因的筛选对解淀粉芽孢杆菌SAP进行全基因组测序，由南方基因组测序中心完成。根据测序注释，寻找中性蛋白酶基因，其核苷酸序列为SEQIDNO:1。通过NCBI同源比对，确定该序列为中性蛋白酶基因。3、引物的合成设计克隆引物，将含有SEQIDNO:1的序列克隆到pUB110表达载体中，上游引物为nprE-F：5'GACCGAGATTTTTTTGAGCAACTTCAGTTTTCATTTGGAATGGGC3'；下游引物为nprE-R：5'CTTGTAGCCATAACAGTTCTTGATCTGTCCGTCCTTCCTTTTTTCC3'。4、目的基因的PCR扩增以解淀粉芽孢杆菌SAP染色体为模板和上下游引物，用NEB公司的Phusion保真酶进行扩增，扩增条件为：98℃预变性2min，98℃变性10s，58℃退火20本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种解淀粉芽孢杆菌工程菌株，其特征在于，所述的解淀粉芽孢杆菌工程菌株携带有用于重组表达中性蛋白酶的重组质粒。/n

【技术特征摘要】
1.一种解淀粉芽孢杆菌工程菌株，其特征在于，所述的解淀粉芽孢杆菌工程菌株携带有用于重组表达中性蛋白酶的重组质粒。


2.如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌工程菌株，其特征在于，所述的中性蛋白酶的编码核苷酸序列为SEQIDNO:1。


3.一种解淀粉芽孢杆菌突变菌株，其特征在于，所述的解淀粉芽孢杆菌突变菌株的保藏...

【专利技术属性】
技术研发人员：张霞，齐建，石增秀，李冬冬，黄亦钧，
申请(专利权)人：青岛蔚蓝生物集团有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37