产N-乙酰-5-羟色胺的重组大肠杆菌及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了产N‑乙酰‑5‑羟色胺的重组大肠杆菌及其构建方法和应用。本发明专利技术首先公开了重组大肠杆菌，与受体大肠杆菌相比，其色氨酸衍生物合成相关蛋白的基因的表达量增加和/或所述色氨酸衍生物合成相关蛋白的含量增加和/或所述色氨酸衍生物合成相关蛋白的活性增加；所述色氨酸衍生物合成相关蛋白选自如下至少一种：苯丙氨酸羟化酶、二氢单磷酸还原酶、4a‑羟基四氢生物蝶呤脱水酶、天冬氨酸转氨酶家族蛋白和N‑乙酰转移酶。进一步公开了重组大肠杆菌的构建方法及应用。本发明专利技术产N‑乙酰‑5‑羟色胺的重组大肠杆菌N‑乙酰‑5‑羟色胺合成效率显著高于其它现有菌株，对N‑乙酰‑5‑羟色胺的工业化生产和大规模应用具有重大意义。

Recombinant Escherichia coli producing n-acetyl-5-hydroxytryptamine and its construction and Application

【技术实现步骤摘要】
产N-乙酰-5-羟色胺的重组大肠杆菌及其构建方法和应用
本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及一种产N-乙酰-5-羟色胺的重组大肠杆菌及其构建方法和应用。
技术介绍
N-乙酰-5-羟色胺(N-Acetyl-serotonin,C12H14N2O2)属于色氨酸的衍生物，是褪黑素合成的前体，其合成途径广泛存在于自然界生物中，细胞内经典的合成途径为：色氨酸—5-羟色氨酸—5-羟色胺—N-乙酰-5-羟色胺。N-乙酰-5-羟色胺在生物体内发挥着许多重要作用，作为褪黑素前体，N-乙酰-5-羟色胺也具有良好的抗氧化能力，如可以有效地防护紫外光可能引起的光致癌及DNA损伤，同时N-乙酰-5-羟色胺对脑损伤/中风/神经损伤恢复中发挥重要作用，具有神经保护剂的功能。目前为止，N-乙酰-5-羟色胺生产是由化学合成完成的，其合成步骤繁琐、得率较低、手性不唯一，不可避免地产生原料浪费和化学污染。随着合成生物学的发展，越来越多的化合物实现了生物绿色生产，通过推测化合物在原宿主中的可能合成路线，鉴定出涉及的基因，解析出目标化合物的合成途径，在生产菌株中通过分子生物学技术引入相关基因重现合成途径，从廉价的原料如葡萄糖催化出高附加值的目标产物。虽然，色氨酸衍生物的合成途径解析的非常清楚，但其中涉及的蛋白本身比活较低，多数难以在现有的成熟表达系统中表达，基本形成包涵体或表达量极低，因此,目前为止还有没有高产N-乙酰-5-羟色胺的工程菌株。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题为提供N-乙酰-5-羟色胺高产菌株，以实现发酵法高效大规模工业化生产N-乙酰-5-羟色胺。为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了一种重组大肠杆菌。本专利技术所述重组大肠杆菌与受体大肠杆菌相比，所述重组大肠杆菌中色氨酸衍生物合成相关蛋白的基因的表达量增加和/或所述色氨酸衍生物合成相关蛋白的含量增加和/或所述色氨酸衍生物合成相关蛋白的活性增加；所述色氨酸衍生物合成相关蛋白选自如下至少一种：P1)苯丙氨酸羟化酶；P2)二氢单磷酸还原酶(folM)；P3)4a-羟基四氢生物蝶呤脱水酶(phhB)；P4)天冬氨酸转氨酶家族蛋白(aspartateaminotransferasefamilyprotein)；P5)N-乙酰转移酶(N-acetyltransferase)。上述重组大肠杆菌中，所述苯丙氨酸羟化酶(记为X)来自野油菜黄单胞菌(Xanthomonascampestrispv.campestrisstr.ATCC33913)、二氢单磷酸还原酶(folM，记为M)来自大肠杆菌(Escherichiacolistr.K-12substr.MG1655)、4a-羟基四氢生物蝶呤脱水酶(phhB，记为P)来自铜绿假单胞菌(PseudomonasaeruginosaPAO1)、天冬氨酸转氨酶家族蛋白(aspartateaminotransferasefamilyprotein，NCBIReferenceSequence:WP_103377132.1，记为H)和N-乙酰转移酶(N-acetyltransferase，NCBIReferenceSequencWP_020929557.1，记为F)来自小白链霉菌(Streptomycesalbulus)。上述重组大肠杆菌中，所述受体大肠杆菌可为大肠杆菌K12；具体为大肠杆菌K12菌株BW25113。在本专利技术具体的实施方式中，所述苯丙氨酸羟化酶可为如下A1)或A2)所示的蛋白质：A1)SEQIDNo.1第319-1209位所示的DNA分子编码的蛋白质；A2)将A1)中的蛋白质的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质；所述二氢单磷酸还原酶可为如下A3)或A4)所示的蛋白质：A3)SEQIDNo.1第1615-2337位所示的DNA分子编码的蛋白质；A4)将A3)中的蛋白质的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A3)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质；所述4a-羟基四氢生物蝶呤脱水酶可为如下A5)或A6)所示的蛋白质：A5)SEQIDNo.1第1234-1590位所示的DNA分子编码的蛋白质；A6)将A5)中的蛋白质的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A5)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质；所述天冬氨酸转氨酶家族蛋白可为如下A7)或A8)所示的蛋白质：A7)SEQIDNo.1第2362-3831位所示的DNA分子编码的蛋白质；A8)将A7)中的蛋白质的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A7)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质；所述N-乙酰转移酶可为如下A9)或A10)所示的蛋白质：A9)SEQIDNo.1第3856-4404位所示的DNA分子编码的蛋白质；A10)将A9)中的蛋白质的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A9)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质。其中，SEQIDNo.1第319-1209位由891个核苷酸组成，第319-1209位为编码序列，编码SEQIDNo.6所示的苯丙氨酸羟化酶。SEQIDNo.1第1615-2337位由723个核苷酸组成，第1615-2337位为编码序列，编码SEQIDNo.7所示的二氢单磷酸还原酶。SEQIDNo.1第1234-1590位由357个核苷酸组成，第1234-1590位为编码序列，编码SEQIDNo.8所示的4a-羟基四氢生物蝶呤脱水酶。SEQIDNo.1第2362-3831位由1470个核苷酸组成，第2362-3831位为编码序列，编码SEQIDNo.9所示的天冬氨酸转氨酶家族蛋白。SEQIDNo.1第3856-4404位由549个核苷酸组成，第3856-4404位为编码序列，编码SEQIDNo.10所示的N-乙酰转移酶。上述重组大肠杆菌中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gapexistencecost，Perresiduegapcost和Lambdaratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。上述重组大肠杆菌中，所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。上述重组大肠杆菌中，所述苯丙氨酸羟化酶的基因可为如下B1)或B2)所示：B1)编码序列为SEQID本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组大肠杆菌，其特征在于：所述重组大肠杆菌与受体大肠杆菌相比，所述重组大肠杆菌中色氨酸衍生物合成相关蛋白的基因的表达量增加和/或所述色氨酸衍生物合成相关蛋白的含量增加和/或所述色氨酸衍生物合成相关蛋白的活性增加；/n所述色氨酸衍生物合成相关蛋白选自如下至少一种：/nP1)苯丙氨酸羟化酶；/nP2)二氢单磷酸还原酶；/nP3)4a-羟基四氢生物蝶呤脱水酶；/nP4)天冬氨酸转氨酶家族蛋白；/nP5)N-乙酰转移酶。/n

【技术特征摘要】
1.一种重组大肠杆菌，其特征在于：所述重组大肠杆菌与受体大肠杆菌相比，所述重组大肠杆菌中色氨酸衍生物合成相关蛋白的基因的表达量增加和/或所述色氨酸衍生物合成相关蛋白的含量增加和/或所述色氨酸衍生物合成相关蛋白的活性增加；
所述色氨酸衍生物合成相关蛋白选自如下至少一种：
P1)苯丙氨酸羟化酶；
P2)二氢单磷酸还原酶；
P3)4a-羟基四氢生物蝶呤脱水酶；
P4)天冬氨酸转氨酶家族蛋白；
P5)N-乙酰转移酶。


2.一种重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于：所述构建方法包括如下步骤：将色氨酸衍生物合成相关蛋白的基因导入受体大肠杆菌，得到重组大肠杆菌；
所述色氨酸衍生物合成相关蛋白的基因选自如下至少一种：
P1)苯丙氨酸羟化酶基因；
P2)二氢单磷酸还原酶基因；
P3)4a-羟基四氢生物蝶呤脱水酶基因；
P4)天冬氨酸转氨酶家族蛋白基因；
P5)N-乙酰转移酶基因。


3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于：所述色氨酸衍生物合成相关蛋白的基因导入受体大肠杆菌是对所述受体大肠杆菌基因组进行下述M1)-M5)全部、任四种、任三种、任两种或任一种的改造得到的：
M1)过表达苯丙氨酸羟化酶基因；
M2)过表达二氢单磷酸还原酶基因；
M3)过表达4a-羟基四氢生物蝶呤脱水酶基因；
M4)过表达天冬氨酸转氨酶家族蛋白基因；
M5)过表达N-乙酰转移酶基因。


4.根据权利要求2或3所述的构建方法，其特征在于：所述色氨酸衍生物合成相关蛋白的基因通过方式甲或方式乙或方式丙导入所述受体大肠杆菌中；
所述方式甲为所述苯丙氨酸羟化酶的基因构建在一个表达载体上，所述N-乙酰转移酶、天冬氨酸转氨酶家族蛋白、4a-羟基四氢生物蝶呤脱水酶和二氢单磷酸还原酶的基因构建在另一个表达载体上，所述表达载体中四个基因的位置关系为天冬氨酸转氨酶家族蛋白、N-乙酰转移酶、4a-羟基四氢生物蝶呤脱水酶和二氢单磷酸还原酶的基因依次连接，然后均导入到受体大肠杆菌中；
所述方式乙为所述苯丙氨酸羟化酶、4a-羟基四氢生物蝶呤脱水酶和二氢单磷酸还原酶的基因构建在一个表达载体上，所述表达载体中三个基因的位置关系为苯丙氨酸羟化酶、4a-羟基四氢生物蝶呤脱水酶和二氢单磷酸还原酶的基因依次连接；所述天冬氨酸转氨酶家族蛋白和N-乙酰转移酶的基因构建在同一个表达载体上，然后均导入到受体大肠杆菌中；
所述方式丙为所述苯丙氨酸羟化酶、4a-羟基四氢生物蝶呤脱水酶、二氢单磷酸还原酶、天冬氨酸转氨酶家族蛋白和N-乙酰转移酶的基因构建在一个表达载体上，所述表达载体中五个基因的位置关系为苯丙氨酸羟化酶、4a-羟基四氢生物蝶呤脱水酶、二氢单磷酸还原酶、天冬氨酸转氨酶家族蛋白和N-乙酰转移酶的基因依次连接，然后导入到受体大肠杆菌中。


5.根据权利要求所述的重组大肠杆菌，或权利要求2-4任一所述的构建方法，其特征在于：所述苯丙氨酸羟化酶来自野油菜黄单胞菌，二氢单磷酸还原酶来自大肠杆菌，4a-羟基四氢生物蝶呤脱水酶来自铜绿假单胞菌，N-乙酰转移酶和天冬氨酸转氨酶家族蛋白来自小白链霉菌。


6.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，或权利要求2-4所述的构建方法，其特征在于：所述苯丙氨酸羟化酶为如下A1)或A2)所示的蛋白质：
A1)SEQIDNo.1第319-1209位所示的DNA分子编码的蛋白质；
A2)将A1)中的蛋白质的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质；
所述二氢单磷酸还原酶为如下A3)或A4)所示的蛋白质：
A3)SEQIDNo.1第1615-2337位所示的...

【专利技术属性】
技术研发人员：董志扬，张岩峰，张山，何永志，张楠，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11