本发明专利技术公开了一种新的产N-乙酰神经氨酸大肠杆菌工程菌及构建方法和应用，该工程菌是通过将编码6-磷酸葡萄糖胺乙酰化酶基因、N-乙酰葡萄糖胺-2-异构酶基因和N-乙酰神经氨酸合成酶基因导入大肠杆菌表达，把大肠杆菌自身的6-磷酸葡萄糖胺脱氨酶基因加强表达，并敲除大肠杆菌中的N-乙酰神经氨酸分解利用代谢途径酶的基因构建而成的重组大肠杆菌。本发明专利技术得到的工程菌株可用于利用葡萄糖或甘油为底物进行发酵培养合成N-乙酰神经氨酸。
【技术实现步骤摘要】
一种新的产N-乙酰神经氨酸大肠杆菌工程菌及其构建方法和应用
本专利技术涉及一种新的产N-乙酰神经氨酸大肠杆菌工程菌及其构建方法和应用， 属生物工程
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技术介绍
唾液酸是指一系列含有9个碳原子并具有吡喃糖结构的酸性氨基糖，系统命名为 5-氨基_3，5- 二脱氧-D-甘油-D-半乳壬酮糖。唾液酸在自然界中分布广泛，已经发现许多生物体内都有唾液酸的存在，目前发现的唾液酸已有50余种，N-乙酰-D-神经氨酸 (Neu5Ac)是唾液酸的主要种类，它的含量占整个唾液酸家族的99%以上，通常以α -糖苷的形式位于非还原性寡聚糖如糖蛋白和糖脂的末端。近些年来，唾液酸已经越来越多的受到人们的关注，唾液酸已经成功在食品、医药和疾病诊断等领域得到应用，添加到婴儿奶粉中可以提高婴儿的智力和记忆力，提高其免疫能力。添加到饮料中可以预防感冒，增加肠道对维生素及矿物质的吸收。可以作为抗流感病毒药物合成的前体物质，对于肝病及肿瘤等的诊断具有重要价值。从1964年Blix发现唾液酸至今，人们已经发现了多种唾液酸的生产方法，尤其是生产唾液酸中主成分N-乙酰神经氨酸的一些方法，包括天然原料提取法、化学合成法、酶催化法和发酵法等。其中天然原料提取法可得到高质量无污染的唾液酸产品，但由于天然原料中唾液酸含量极低，导致该方法唾液酸的生产成本居高不下，限制了其大面积推广应用。化学合成、酶催化在生产过程中需要添加昂贵的原料和有害的有机溶剂，导致其生产出来的唾液酸往往只能用于药物的合成，而无法应用于食品和保健品。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种新的产N-乙酰神经氨酸基因工程菌及其构建方法和应用。本专利技术通过构建新的高产N-乙酰神经氨酸的基因工程大肠杆菌，提高了 N-乙酰神经氨酸的产量。 为解决上述技术问题，本专利技术的产N-乙酰神经氨酸代谢工程菌，首先是通过引入并高表达6-磷酸葡萄糖胺乙酰化酶基因(GNA1)、N-乙酰葡萄糖胺-2-异构酶基因(AGE) 和N-乙酰神经氨酸合成酶基因(neuB)，架构起从葡萄糖到N-乙酰神经氨酸的合成通路， 实现利用葡萄糖合成N-乙酰神经氨酸的目的。为了提高N-乙酰神经氨酸的产量，高表达了 6-磷酸葡萄糖胺脱氨酶基因(nagB)以提高前体物氨基葡萄糖的供应量。为进一步提高N-乙酰神经氨酸的产率，还可以敲除该代谢工程菌中的N-乙酰神经氨酸分解利用代谢途径酶的基因。在一个实施方案中，本专利技术的工程菌敲除乙酰葡萄糖胺脱乙酰酶编码基因 (nagA)以避免中间产物N-乙酰葡萄糖胺的分解；敲除N-乙酰神经氨酸分解代谢基因簇 nanATEK,阻断N-乙酰神经氨酸的降解，达到在胞外积累终产物N-乙酰神经氨酸的目的。详见附图1。所述6-磷酸葡萄糖胺乙酰化酶基因来源于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或能表达相同功能酶的微生物，基因的获得可根据GenBank N0.NM_001179949基因序列全基因合成，或利用酿酒酵母(如菌株S288C)的基因组DNA为模板通过PCR扩增获得，或采用过类似手段从其他生物体获得。所述N-乙酰葡萄糖胺-2-异构酶基因来源于鱼腥藻(Anabaena)或能表达相同功能酶的微生物，基因的获得可根据GenBank N0.DQ661858基因序列全基因合成，或利用鱼腥藻(如藻株Anabaena sp.CHl)的基因组DNA为模板通过PCR扩增获得，或采用过类似手段从其他生物体获得。所述N-乙酰神经氨酸合成酶基因来源于空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)或能表达相同功能酶的微生物，基因的获得可根据GenBank N0.AF400048基因序列全基因合成，或利用空肠弯曲菌(如菌株ATCC43438)的基因组DNA为模板通过PCR扩增获得，或采用过类似手段从其他生物体获得。 所述6-磷酸葡萄糖胺脱氨酶基因来源于大肠杆菌或能表达相同功能酶的微生物，6-磷酸葡萄糖胺脱氨酶基因的获得可根据大肠杆菌W3110基因组GenBankN0.NC_007779的中的nagB基因序列，经全基因合成得到，或利用大肠杆菌基因组DNA为模板通过PCR扩增获得，或采用过类似手段从其他生物体获得。所述6-磷酸葡萄糖胺乙酰化酶基因(GNA1)、N-乙酰葡萄糖胺_2_异构酶基因(AGE)、N-乙酰神经氨酸合成酶基因(neuB)和6-磷酸葡萄糖胺脱氨酶基因(nagB)导入大肠杆菌并高表达，是将这四个基因克隆到表达载体上后，以质粒的方式在大肠杆菌中表达。所述的乙酰葡萄糖胺脱乙酰酶编码基因(nagA)为大肠杆菌自身基因组所有，能将6-磷酸-N-乙酰葡萄糖胺分解为6-磷酸葡萄糖胺，不利于N-乙酰神经氨酸前体物6-磷酸-N-乙酰葡萄糖胺的积累，并影响最终N-乙酰神经氨酸的产量。所述分解N-乙酰神经氨酸的nanATEK基因簇为大肠杆菌自身基因组中所有，包含了四个基因，分别为:N-乙酰神经氨酸醛缩酶编码基因nanA、N-乙酰神经氨酸转运蛋白编码基因nanT、N-乙酰-6-磷酸甘露糖胺异构酶编码基因nanE和N-乙酰甘露糖胺激酶编码基因nanK，这四个基因能将N-乙酰神经氨酸从胞外转运至胞内并分解，不利于N-乙酰神经氨酸的积累，具体可参见附图1。本专利技术还公开了上述产N-乙酰神经氨酸代谢工程菌的构建方法，具体步骤包括:将nagB、GNAU AGE和neuB基因分别克隆到表达载体上，转入大肠杆菌中，获得高产N-乙酰神经氨酸代谢工程菌。其中所述四个基因可分别克隆至4个表达载体中，也可以以任何方式组合分别克隆至3个表达载体中，或者以以任何方式组合分别克隆至2个表达载体中。更特别地，可将所述四个基因克隆至一个表达载体中。在一个特别的实施方案中，所述构建方法更加具体的步骤包括:I)克隆6-磷酸葡萄糖胺脱氨酶基因(nagB)至表达载体1，以实现该基因的高表达；2)克隆6-磷酸葡萄糖胺乙酰化酶基因(GNA1)至I)获得的表达载体上，获得双基因表达载体，以实现两个基因的闻表达；3)克隆N-乙酰葡萄糖胺-2-异构酶基因(AGE)至表达载体2 (载体I和2须能共存于同一宿主菌)，以实现该基因的闻表达；4)克隆N-乙酰神经氨酸合成酶基因(neuB)至3)获得的表达载体上，获得双基因表达载体，以实现两个基因的闻表达；5)将2)和4)中获得的双基因表达载体转化大肠杆菌菌株中，获得产N-乙酰神经氨酸代谢工程菌在另一实施方案中，先敲除大肠杆菌中的分解N-乙酰神经氨酸的nanATEK基因簇和分解6-磷酸-N-乙酰葡萄糖胺的nagA基因，将nagB、GNAl、AGE和neuB基因分别克隆到表达载体上，转入敲除了 nanATEK基因簇和nagA基因的大肠杆菌中，获得高产N-乙酰神经氨酸代谢工程菌。其中所述四个基因可分别克隆至4个表达载体中，也可以以任何方式组合分别克隆至3个表达载体中，或者以以任何方式组合分别克隆至2个表达载体中。更特别地，可将所述四个基因克隆至一个表达载体中。在一个特别的实施方案中，该构建方法更加具体的步骤包括:I)敲除上述大肠杆菌中的nagA基因，获得nagA失活的菌株；2)敲除大肠杆菌中的基因簇nanATEK，获得基因簇nanATEK和nagA失活的菌株；3)克隆6-磷酸葡萄糖胺脱氨酶基因(nagB)至表本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种产N?乙酰神经氨酸大肠杆菌工程菌，其特征在于所述工程菌是通过将6?磷酸葡萄糖胺乙酰化酶基因、N?乙酰葡萄糖胺?2?异构酶基因、N?乙酰神经氨酸合成酶基因和6?磷酸葡萄糖胺脱氨酶基因导入大肠杆菌表达构建而成的重组大肠杆菌。
【技术特征摘要】
1.一种产N-乙酰神经氨酸大肠杆菌工程菌，其特征在于所述工程菌是通过将6-磷酸葡萄糖胺乙酰化酶基因、N-乙酰葡萄糖胺-2-异构酶基因、N-乙酰神经氨酸合成酶基因和 6-磷酸葡萄糖胺脱氨酶基因导入大肠杆菌表达构建而成的重组大肠杆菌。2.根据权利要求1所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于所述大肠杆菌还敲除了N-乙酰神经氨酸分解利用代谢途径酶的基因。3.根据权利要求2所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于所述N-乙酰神经氨酸分解利用代谢途径酶的基因包括编码6-磷酸-N-乙酰葡萄糖胺脱乙酰酶的基因nagA、编码N-乙酰神经氨酸醛缩酶的基因nanA、编码N-乙酰神经氨酸转运蛋白的基因nanT、编码N-乙酰-6-磷酸甘露糖胺异构酶的基因nanE和编码N-乙酰甘露糖胺激酶的基因nanK，其中前述后四个基因连在一起，构成一个基因簇nanATEK。4.根据权利要求1至3任一项权利要求所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于所述6-磷酸葡萄糖胺乙酰化酶基因、N-乙酰葡萄糖胺-2-异构酶基因、N-乙酰神经氨酸合成酶基因和6-磷酸葡萄糖胺脱氨酶基因导入大肠杆菌并高表达，是将这四个基因克隆到质粒表达载体上后，以质粒的方式在大肠杆囷中表达。5.根据权利要求1至3任一项权利要求所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于所述6-磷酸葡萄糖胺...
【专利技术属性】
技术研发人员：柳鹏福，孙立洁，王纪，袁丽霞，刘洋，吴金勇，陈祥松，史吉平，姚建铭，
申请(专利权)人：武汉中科光谷绿色生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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