nagB基因改造的弗式链霉菌重组菌及制备方法和应用技术

本发明专利技术提供nagB基因改造的弗式链霉菌重组菌及制备方法和应用，所述重组菌内含有由P

【技术实现步骤摘要】
nagB基因改造的弗式链霉菌重组菌及制备方法和应用


[0001]本专利技术属于基因工程菌改造
，尤其是一种nagB基因改造的弗式链霉菌重组菌及制备方法和应用。

技术介绍

[0002]链霉菌在分类学上属于原核生物界放线菌目链霉菌科，具有多样化的基因组和极高的GC（70～76%）含量。自然界约70％的抗生素是由链霉菌及其近缘放线菌产生。新霉素是由弗氏链霉菌产生的氨基糖苷类抗生素，能够干扰蛋白质合成，是国内外最为常用的兽用抗生素之一。其主要成分为新霉素B和C，以及少量新霉素A。新霉素B相对其他组分而言活性强、毒性低，是发酵过程中需要监测的主要组分。
[0003]目前，我国生产的新霉素主要用于出口，面向欧洲、美洲等地，且有供不应求之势，然而我国新霉素产量偏低、成本高，工业生产商采用的研究手段仍停留在上世纪80年代所采用的随机诱变或优化培养条件上，缺乏从菌种自身进行理性改造而提高新霉素合成能力的操作，较为落后的菌种改良技术与日益增长的供应需求间形成了新的矛盾。因此，如何理性改造新霉素生产菌株使其产量进一步提高，满足微生物制药市场需求是目前亟待解决的关键问题。
[0004]葡萄糖胺
‑6‑
磷酸脱氨酶（简称“NagB”）在弗氏链霉菌中的UDP
‑
GlcNAc合成途径中存在。弗氏链霉菌中的UDP
‑
GlcNAc合成途径包括以下步骤：由果糖
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磷酸(Fru
‑6‑
P)在四个连续的酶促反应中通过三种酶：GlcNAc激酶(GlmS)、GlcNAc磷酸变位酶(GlmM)和UDP
‑
GlcNAc焦磷酸化酶（GlmU）来合成UDP
‑
GlcNAc，具体为：首先，果糖
‑6‑
磷酸（Fru
‑6‑
P）通过GlcNAc激酶(GlmS)转化为葡萄糖胺
‑6‑
磷酸(GlcN
‑6‑
P)，与此同时，葡萄糖胺
‑6‑
磷酸(GlcN
‑6‑
P)在葡萄糖胺
‑6‑
磷酸脱氨酶（NagB）的作用下还会逆转化为果糖
‑6‑
磷酸(Fru
‑6‑
P)；接着，在GlcNAc磷酸变位酶(GlmM)处于磷酸化状态下，GlcN
‑6‑
P催化生成葡萄糖胺
‑1‑
磷酸(D
‑
GlcN
‑
1P)；最后， D
‑
GlcN
‑1‑
P在UDP
‑
GlcNAc焦磷酸化酶（GlmU）的作用下，乙酰化形成乙酰葡萄糖胺
‑1‑
磷酸（GlcNAc
‑1‑
P），GlcNAc
‑1‑
P再在UDP
‑
GlcNAc焦磷酸化酶（GlmU）的作用下形成UDP
‑
GlcNAc（如图1所示）。由此可知，NagB是弗氏链霉菌中GlcN
‑6‑
P转化为Fru
‑6‑
P的关键酶。但是，调节NagB的表达水平与弗氏链霉菌发酵后产新霉素的联系目前尚未解析，不可预知。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的之一在于提供nagB基因改造的弗式链霉菌（Streptomyces fradiae）重组菌，提高菌株的新霉素生产能力。
[0006]nagB基因改造的弗式链霉菌重组菌，其菌内含有由P
sco4503
启动子、nagB基因和终止子三者顺序拼接而成的外源融合基因。
[0007]本专利技术首次通过在弗式链霉菌中过表达nagB基因，并通过P
sco4503
启动子来调节葡萄糖胺
‑6‑
磷酸脱氨酶（NagB）在弗式链霉菌菌体内的表达水平，从而提高重组菌的新霉素
g/L硫酸铵，2
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10g/L 氯化钠，0.1
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0.5g/L 磷酸氢二钠，1
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8g/L轻质碳酸钙，0.1
‑
0.5g/L淀粉酶，pH 7.2
‑
7.7。
附图说明
[0015]图1是现有的UDP
‑
GlcNAc合成途径示意图。
具体实施方式
[0016]下面对本专利技术的具体实施方式作详细的说明：本专利技术所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
[0017]本专利技术的nagB基因改造的弗式链霉菌重组菌，其菌内含有由P
sco4503
启动子、nagB基因和终止子三者顺序拼接而成的外源融合基因。
[0018]所述nagB基因改造的弗式链霉菌重组菌的构建方法为：将P
sco4503
启动子、nagB基因和终止子通过SOE
‑
PCR（即重叠延伸PCR）顺序拼接形成外源融合基因，并将所述外源融合基因通过表达质粒导入原始弗式链霉菌中得到弗式链霉菌重组菌，所述原始弗式链霉菌为产新霉素的弗氏链霉菌。具体构建步骤为：（1）以弗氏链霉菌Sf01的基因组DNA为模板，PCR扩增出所述nagB基因（所用引物为：nagB
‑
F和nagB
‑
R）以及所述终止子，其中所述终止子具体为终止子Taph（所用引物为：Taph
‑
F和Taph
‑
R）；以天蓝色链霉菌M145的基因组为模板，PCR扩增出所述P
sco4503
启动子（所用引物为：4503
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F和4503
‑
R）；通过SOE
‑
PCR将所述P
sco4503
启动子、所述nagB基因和所述终止子Taph顺序拼接起来形成所述外源融合基因；其中，所述P
sco4503
启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO.2中所示；所述nagB基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1中所示；所述终止子的核苷酸序列为SEQ ID NO.6中所示；所用引物如下：nagB
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F：gtggaagttgtcatcgtcca、nagB
‑
R：ctagagcccctgccaggagg；Taph
‑
F：cctcctggcaggggctctagcgagttcttctagagccgcc、Taph
‑
R：gctatgacatgattacgaattcgatcggctcccggccaggccg；4503
‑
F：gtaaaacgacggccagtgccaagccctcgccgagcgggaggg、4503
‑
R：tggacgatgacaacttccacgggcggctcctgggacgtg；（2）所述表达质粒选用质粒pSET152，以pSET152质粒为模版，P本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
7.2
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【专利技术属性】
技术研发人员：陈守文，魏子涵，金辉，蔡冬波，罗淦，李俊辉，
申请(专利权)人：绿康生化股份有限公司，
类型：发明
国别省市：