一种高效合成乳糖的方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种高效合成乳糖的方法及其应用，属于代谢工程和食品发酵领域。本发明专利技术采用CRISPR/Cas9基因编辑技术对底盘微生物进行改造，通过重构葡萄糖转运途径、乳糖合成途径、调控中心碳代谢、解除阻遏蛋白的阻遏抑制、模块途径优化等策略实现无抗和有抗菌株的构建。本发明专利技术得到的重组工程菌可以实现乳糖的生产，在并可利用甘油和葡萄糖实现高效合成乳糖，产物生产水平高，具有较强的社会经济效益，市场开发前景广阔。开发前景广阔。开发前景广阔。

【技术实现步骤摘要】
一种高效合成乳糖的方法及其应用


[0001]本专利技术涉及一种高效合成乳糖的方法及其应用，属于代谢工程和食品发酵领域。

技术介绍

[0002]乳糖是哺乳动物乳汁中特有的碳水化合物，是由葡萄糖和半乳糖通过1，4
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糖苷键连接而成的双糖。乳糖的合成是在乳腺上皮细胞内的高尔基体内完成的，其过程涉及多级酶反应催化。乳糖在人体肠道内易被β
‑
半乳糖苷酶分解成葡萄糖和半乳糖，葡萄糖主要为机体提供能量，而半乳糖以糖苷键结合于神经酰胺上，形成半乳糖脑苷脂，从而参与大脑的发育。此外，乳糖能促进人体肠道内某些乳酸菌的生成，能抑制腐败菌的生长，有助于肠道的蠕动。因此，乳糖常被应用于婴幼儿食品和药物制品。
[0003]传统上，乳糖是从牛奶的乳清中经浓缩、结晶、精制、重结晶、干燥后提取得到，过程繁琐且成本较高。近年来，以乳糖为受体，类似于人乳寡糖(Human Milk Oligosaccharides,HMOs)等高附加值产品的开发越来越多，这些功能性产品的合成需要外源乳糖的持续供给，极大地增加了生产成本。因此，通过模拟哺乳动物中的乳糖合成途径，通过微生物细胞工厂设计和开发乳糖合成新技术可以降低在生物合成过程中的乳糖成本。
[0004]绿色、高效、安全型底盘微生物的开发是解决乳糖规模化生产和应用的关键。随着代谢工程和合成生物学的发展，诸多模式微生物被发掘作为化学品和天然产物的潜在微生物细胞工厂。大肠杆菌、芽孢杆菌、乳酸菌、谷氨酸棒状杆菌、酿酒酵母等模式微生物已成功用于功能糖的生物合成。基于上述模式生物生长迅速、培养简单、重组子稳定、载体受体系统完备等特点，结合现有高效的CRISPR
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Cas9基因编辑系统，利用重组工程菌制备乳糖产品已显然成为绿色安全且具备商业价值的生产策略。本专利技术旨在利用合成生物学手段，通过重构葡萄糖转运途径、乳糖合成途径、调控中心碳代谢、解除阻遏蛋白的阻遏抑制、质粒型通路优化等策略实现无抗和有抗菌株的构建及乳糖的高效合成。该研究方法将丰富和发展微生物代谢调控的技术研究，为重构微生物代谢网络、提高碳原子经济性提供新方法和案例，并为理性设计和构建新一代微生物细胞工厂提供新思路，在理论和实际应用方面均具有重要价值。

技术实现思路

[0005][技术问题][0006]现有乳糖的生产方法来源于动物乳，受限于乳品分离，需要多重纯化，步骤繁琐，现有技术无法提供安全、高效生产乳糖的微生物菌株，也不能提供成本低廉且绿色环保的乳糖的制备方法。
[0007][技术方案][0008]本专利技术为了解决乳糖来源受限、成本较高、复杂的纯化工艺等缺陷，提供了一种重组微生物，能够以甘油和葡萄糖为底物高效生产乳糖，具有转化效率高、环境友好度高、生产成本低等优势，适合工业化生产乳糖。
过表达基因GalE和NmlgtB。
[0025]在一种实施方式中，所述β
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半乳糖苷酶基因lacZ的Gene ID为945006，葡萄糖特异性转运蛋白酶基因crr和ptsG的Gene ID为946880和945651，UDP
‑
葡萄糖
‑6‑
脱氢酶基因ugd的Gene ID为946571，UDP
‑
葡萄糖
‑4‑
差向异构酶基因GalE的Gene ID为945354，葡萄糖激酶基因Glk的Gene ID为946858；泛醌依赖性丙酮酸脱氢酶基因poxB的Gene ID为946132，磷酸乙酰转移酶基因pta的Gene ID为946778，乙酸激酶基因ackA的Gene ID为946775，D
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乳酸脱氢酶基因IdhA的Gene ID为946315，甲酸裂解酶基因pflB的Gene ID为945514，乳糖操纵子阻遏蛋白lacI的Gene ID为945007，D
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乳酸脱氢酶基因ldhA的Gene ID为946315。
[0026]在一种实施方式中，所述葡萄糖转运蛋白基因Glf来源于运动发酵单胞菌，糖外排转运蛋白基因SetA来源于伯氏耶尔森氏菌ATCC 43970，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；β
‑
1,4
‑
半乳糖基转移酶分别来源于放线共生放线杆菌的AaGalT、来源于脑膜炎奈瑟菌的NmlgtB、来源于多杀性巴氏杆菌的PmGalT、来源于乳酸奈瑟菌的NLlgtB、来源于肺炎克雷伯菌的KpGalT、来源于睡眠嗜组织菌的HsGalT、来源于铜绿假单胞菌的PawaaX、来源于痢疾志贺氏菌的SdwaaX或来源于大肠杆菌的EcwaaX，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11。
[0027]在一种实施方式中，所述宿主为大肠杆菌、芽孢杆菌、乳酸菌、谷氨酸棒状杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母、米曲霉或黑曲霉等。
[0028]本专利技术的第二个目的是提供所述基因工程菌在合成乳糖及其衍生物产品中的应用。
[0029]在一种实施方式中，所述乳糖衍生产品包括人乳寡糖、低聚半乳糖、低聚乳果糖、乳果糖、乳酮糖、乳糖醇、乳糖酸、塔格糖等。
[0030]在一种实施方式中，将所述基因工程菌接种于发酵培养基，将所述基因工程菌挑取单菌落于LB液体培养基中，在37℃，200rpm，摇瓶培养12h，将种子液按照3％(v/v)的量接种于发酵培养基，发酵初始时加入终浓度为8g/L的葡萄糖，在30～40℃，150～250rpm的条件下培养48h。
[0031]优选地，所述重组大肠杆菌为BP20。
[0032]发酵培养基：甘油30g/L，磷酸二氢钾13.5g/L，柠檬酸1.7g/L，磷酸氢二氨4.0g/L，七水硫酸镁1.4g/L，酵母提取物10g/L，微量金属溶液10mL/L(柠檬酸三铁10g/L，七水硫酸镁2.25g/L，五水硫酸铜1.0g/L，一水硫酸锰0.35g/L，硼砂0.23g/L，钼酸铵0.11g/L，二水氯化钙2.0g/L)，pH 6.8。
[0033]本专利技术的有益效果：
[0034]本专利技术提供的基因工程菌，其失活了PTS
Glc
转运系统并强化了NPTS
Glc
转运系统，增强了葡萄糖的内化效率并防止葡萄糖的磷酸化；筛选了最佳来源的β
‑
1,4
‑
半乳糖基转移酶并构建了乳糖合成通路；弱化了副产物途径并解除了阻遏蛋白的阻遏抑制；通过质粒型通路优化等策略实现了无抗和有抗菌株的构建及乳糖的高效合成。并且可以甘油和葡萄糖为底物，原料价格低廉，来源广泛，转化乳糖的效率高，降低了生产成本和环境污染，为乳糖的工业化生产及乳糖基化学品的微生物生产奠定了基础。
附图说明
[0035]图1为以葡萄糖和甘油为底物生产乳糖的代谢过程示意图本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基因工程菌，其特征在于，所述工程菌敲除了β
‑
半乳糖苷酶基因lacZ、葡萄糖特异性转运蛋白酶EⅡABC
Glc
组件编码基因并在该位点整合了糖外排转运蛋白基因SetA和葡萄糖转运蛋白基因Glf，或敲除了β
‑
半乳糖苷酶基因lacZ、UDP
‑
葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaJ、GDP
‑
甘露糖甘露糖基水解酶基因nudD、6
‑
磷酸果糖激酶
‑
1基因pfkA、蛋白酶基因lon的菌株为宿主菌，敲除了葡萄糖特异性转运蛋白酶EⅡABC
Glc
组件编码基因并在该位点整合了糖外排转运蛋白基因SetA和葡萄糖转运蛋白基因Glf。2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的宿主为大肠杆菌、芽孢杆菌、乳酸菌、谷氨酸棒状杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母、米曲霉或黑曲霉等。3.根据权利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，敲除了葡萄糖激酶基因Glk，并在Glk位点处整合了β
‑
1,4
‑
半乳糖基转移酶；敲除了UDP
‑
葡萄糖
‑6‑
脱氢酶基因ugd，并在ugd位点处整合了UDP
‑
葡萄糖
‑4‑
差向异构酶基因GalE。4.根据权利要求1～3任一所述的基因工程菌，其特征在于，所述β
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【专利技术属性】
技术研发人员：张涛，李梦丽，骆叶姣，江波，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：