【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种同时利用葡萄糖与甘露醇的地衣芽孢杆菌重组菌株，属于合成生物学与代谢工程。
技术介绍
1、地衣芽胞杆菌(bacillus licheniformis)是一种重要的食品安全型微生物，其具有酶系丰富，耐热，蛋白折叠充分，安全等优点，受到合成生物学的青睐。由于碳分解代谢效应(ccr)的存在，地衣芽孢杆菌在利用碳源上表现出明显的层次顺序。例如，在葡萄糖与木糖混合碳源下，先前研究表明地衣芽孢杆菌优先利用葡萄糖，并抑制木糖的分解代谢，参考文献《ccpa mutants infuence selective carbon source utilization by changinginteractions with target genes in bacillus licheniformis》。这种现象一方面延长了地衣芽孢杆菌的发酵周期，因为碳源从葡萄糖切换到另外的碳源时常存在一段时间的平台期；另一方面延缓了合成生物学元件的开发，例如淀粉酶启动子受到葡萄糖介导的ccr效应，即使在多拷贝质粒上也不可避免。因此，解除葡萄糖介导的ccr效应，实现葡萄糖与受抑制碳源的共同利用具有重要的意义。
2、海洋中存在着丰富的海藻生物质，可以作为生物发酵的碳底物来源。第三代生物质指的是以海藻生物质为主的海洋资源生物质，其水解产物主要包含甘露醇与葡萄糖。因此，甘露醇在混合碳源环境下的利用效率与利用模式直接决定了第三代可再生生物质的利用水平。而由于ccr效应的存在，微生物在利用葡萄糖与甘露醇之间存在明显的先后顺序，并且甘露醇代谢基因的转录
3、当前，芽孢杆菌中ccr效应的关键转录因子为ccpa蛋白，关键靶点为cre位点。在地衣芽孢杆菌甘露醇操纵子中存在明显的cre位点，表明甘露醇代谢基因受到ccpa-cre共同介导的ccr效应。如何解除葡萄糖介导的ccr效应，实现葡萄糖与甘露醇的共利用是实现第三代可再生生物质高效利用的重中之重。
技术实现思路
1、当前，在革兰氏阳性菌中并未有实现葡萄糖与甘露醇共同利用的方法。本研究首次提供一种实现葡萄糖与甘露醇共同利用的方法，改变了地衣芽孢杆菌碳源利用模式。为解决目前存在的技术问题，本专利技术通过代谢工程改造，使得地衣芽孢杆菌可以共利用葡萄糖与甘露醇进行代谢，改变了地衣芽胞杆菌对葡萄糖与甘露醇之间层级利用的代谢模式。
2、本专利技术提供了一种可以共利用葡萄糖与甘露醇的地衣芽孢杆菌重组菌株，所述地衣芽胞杆菌重组菌株过表达了地衣芽孢杆菌来源的甘露醇转运蛋白iicbmtl，甘露醇转运蛋白iiamtl和甘露醇1-磷酸脱氢酶。
3、在一种实施方式中，所述甘露醇转运蛋白iicbmtl的氨基酸序列如seq id no.3所示；所述甘露醇转运蛋白iiamtl的氨基酸序列如seq id no.4所示；所述甘露醇1-磷酸脱氢酶的氨基酸序列如seq id no.5所示。
4、在一种实施方式中，编码所述甘露醇转运蛋白iicbmtl的基因mtla的核苷酸序列如seq id no.6所示；编码所述甘露醇转运蛋白iiamtl的基因mtlf的核苷酸序列如seq idno.7所示；编码所述甘露醇1-磷酸脱氢酶的基因mtld的核苷酸序列如seq id no.8所示。
5、在一种实施方式中，所述地衣芽孢杆菌重组菌株过表达了含有mtla(编码甘露醇转运蛋白iicbmtl)、mtlf(编码甘露醇转运蛋白iiamtl)和mtld(编码甘露醇1-磷酸脱氢酶)的表达框。
6、在一种实施方式中，利用启动子p2对基因进行过表达，利用终止子ter终止基因的表达。
7、在一种实施方式中，启动子p2的核苷酸序列如seq id no.1所示，终止子ter的核苷酸序列如seq id no.2所示。
8、在一种实施方式中，所述地衣芽孢杆菌重组菌株的出发菌株为地衣芽胞杆菌cicim b1391δccpa，已公开于论文《ccpa mutants infuence selective carbon sourceutilization by changing interactions with target genes in bacilluslicheniformis》中。
9、在一种实施方式中，以质粒phy-plk300为表达载体。
10、在一种实施方式中，利用质粒phy-plk300表达mtla、mtlf和mtld。
11、本专利技术提供了含有上述地衣芽孢杆菌工程菌株的微生物制剂。
12、本专利技术提供了一种同时利用葡萄糖与甘露醇的方法，所述方法为利用上述地衣芽胞杆菌重组菌株或上述微生物制剂，在葡萄糖与甘露醇混合碳源下，驱动两种碳源的共利用。
13、有益效果：
14、本专利技术通过在ccpa缺失菌株中过表达mtla(编码甘露醇转运蛋白iicbmtl)，mtlf(编码甘露醇转运蛋白iiamtl)，mtld(编码甘露醇1-磷酸脱氢酶)，使得甘露醇代谢途径不再受到葡萄糖的分解代谢抑制，使得地衣芽孢杆菌在面对葡萄糖与甘露醇时可以共利用。本专利技术的技术方案可以明显改变地衣芽孢杆菌的碳源偏好性，可以实现葡萄糖与甘露醇的共同利用。
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1.一种可以共利用葡萄糖与甘露醇的重组地衣芽孢杆菌，其特征在于，过表达了地衣芽孢杆菌来源的甘露醇转运蛋白IICBMtl，甘露醇转运蛋白IIAMtl和甘露醇1-磷酸脱氢酶。
2.根据权利要求1所述的重组地衣芽孢杆菌，其特征在于，所述甘露醇转运蛋白IICBMtl的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述甘露醇转运蛋白IIAMtl的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述甘露醇1-磷酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
3.根据权利要求2所述的重组地衣芽孢杆菌，其特征在于，编码所述甘露醇转运蛋白IICBMtl的基因mtlA的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；编码所述甘露醇转运蛋白IIAMtl的基因mtlF的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；编码所述甘露醇1-磷酸脱氢酶的基因mtlD的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
4.根据权利要求3所述的重组地衣芽孢杆菌，其特征在于，利用启动子P2对基因进行过表达，利用终止子ter终止基因的表达。
5.根据权利要求4所述的重组地衣芽孢杆菌，其特征在于，启动子P2
6.根据权利要求1～5任一所述的重组地衣芽孢杆菌，其特征在于，所述地衣芽孢杆菌重组菌株的出发菌株为地衣芽胞杆菌CICIM B1391ΔccpA。
7.根据权利要求1～6任一所述的重组地衣芽孢杆菌，其特征在于，以质粒pHY-PLK300为表达载体。
8.含有权利要求1～7任一所述重组地衣芽孢杆菌的微生物制剂。
9.一种共利用葡萄糖与甘露醇的方法，其特征在于，将权利要求1～7任一所述的重组地衣芽胞杆菌或权利要求8所述的微生物制剂在含葡萄糖和甘露醇的培养基中培养。
10.权利要求1～7任一所述的重组地衣芽孢杆菌或权利要求8所述的微生物制剂在生产氨基酸中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种可以共利用葡萄糖与甘露醇的重组地衣芽孢杆菌，其特征在于，过表达了地衣芽孢杆菌来源的甘露醇转运蛋白iicbmtl，甘露醇转运蛋白iiamtl和甘露醇1-磷酸脱氢酶。
2.根据权利要求1所述的重组地衣芽孢杆菌，其特征在于，所述甘露醇转运蛋白iicbmtl的氨基酸序列如seq id no.3所示；所述甘露醇转运蛋白iiamtl的氨基酸序列如seq id no.4所示；所述甘露醇1-磷酸脱氢酶的氨基酸序列如seq id no.5所示。
3.根据权利要求2所述的重组地衣芽孢杆菌，其特征在于，编码所述甘露醇转运蛋白iicbmtl的基因mtla的核苷酸序列如seq id no.6所示；编码所述甘露醇转运蛋白iiamtl的基因mtlf的核苷酸序列如seq id no.7所示；编码所述甘露醇1-磷酸脱氢酶的基因mtld的核苷酸序列如seq id no.8所示。
4.根据权利要求3所述的重组地衣芽孢杆菌，其特征在于，利用...
【专利技术属性】
技术研发人员：肖丰旭，李由然，石贵阳，张玉鹏，张丽欢，张梁，丁重阳，徐沙，顾正华，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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