一种生物酶催化制备水溶性阿魏酸衍生物的方法技术

本发明专利技术公开了一种生物酶催化制备水溶性阿魏酸衍生物的方法，属于酶工程领域。本发明专利技术将来源于Aspergillus niger的阿魏酸酯酶基因faeA克隆至表达载体获得重组载体，并将所述重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3)获得重组细胞，并诱导表达重组酶阿魏酸酯酶FAE

【技术实现步骤摘要】
一种生物酶催化制备水溶性阿魏酸衍生物的方法


[0001]本专利技术涉及一种生物酶催化制备水溶性阿魏酸衍生物的方法，属于酶工程领域。

技术介绍

[0002]阿魏酸(Ferulic Acid)化学名称为4
‑
羟基
‑3‑
甲氧基苯丙烯酸或4
‑
羟基
‑3‑
甲氧基肉桂酸，广泛存在于植物界中的一种酚酸。阿魏酸能抑制血栓和血小板凝集，抗氧化和清除自由基，增强免疫功能，抗菌、抗病毒、抗肿瘤等功效；并且它能被人体吸收并易于从尿中排出,不会在体内累积，因此是一种安全性极高的药物。阿魏酸还可以作为天然防晒剂，预防或减少紫外线对皮肤的损伤；能显著抑制酪氨酸酶活性及黑色素细胞的增殖，减少黑色素的生成从而达到美白祛斑的效果。日本已允许其作为食品添加剂使用，可作为抗氧化剂和机能促进物质应用于运动食品中，也可作为交联剂逐渐地应用于制备食品胶和可食性包装膜中。由于其具有良好的生理功效，因此在医药、化妆品和食品等领域中拥有广阔的应用前景。
[0003]阿魏酸十分不稳定，容易受外界因素(如光照、pH、温度等)影响发生降解，且水溶性和脂溶性都比较差，从而限制了它的广泛应用。因此要提高阿魏酸的应用必须对其改性以提高其水溶性或脂溶性。目前，大多数的研究都是关于提高阿魏酸脂溶性的，而提高其水溶解性的硏究还是比较少。
[0004]本申请的专利技术人通过研究发现，阿魏酸甘油酯和阿魏酸二甘油酯具有比阿魏酸更优的水溶解性，更容易在化妆品领域，特别是护肤品领域使用。
专利技术内容
[0005]本专利技术的目的是提供水溶性阿魏酸衍生物的制备方法，获得的阿魏酸衍生物具有比阿魏酸更优的水溶解性，拓宽阿魏酸及其衍生物的应用范围。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案实现：
[0007]本专利技术的第一个目的是提供一种生物酶催化制备水溶性阿魏酸衍生物的方法，以甘油和/或二甘油组成的混合物以及阿魏酸为底物，加入阿魏酸酯酶(EC:3.1.1.73)进行催化反应，获得水溶性阿魏酸衍生物。
[0008]在一种实施方式中，所述所述水溶性阿魏酸衍生物为阿魏酸甘油酯(Ⅰ)和阿魏酸二甘油酯(Ⅱ)，其结构式如下：
[0009][0010]在一种实施方式中，所述阿魏酸酯酶来源于Aspergillus niger，
[0011]在一种实施方式中，所述阿魏酸酯酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0012]在一种实施方式中，所述的阿魏酸酯酶以全细胞、粗酶液、纯酶或者固定化酶的形式发挥催化作用。
[0013]在一种实施方式中，所述阿魏酸酯酶的用量按其在反应体系中的终含量为2U
‑
20U添加计算。
[0014]在一种实施方式中，所述阿魏酸酯酶的用量按其在反应体系中的终含量为10U添加计算。
[0015]在一种实施方式中，所述混合物中，甘油和二甘油的配比用量为(1:1)
‑
(1：10)添加计算。
[0016]在一种实施方式中，所述混合物中，甘油和二甘油的配比用量为1:1添加计算。
[0017]在一种实施方式中，所述阿魏酸和混合物的用量按其在反应体系中的投料质量比为(1：5)
‑
(1：25)添加计算。
[0018]在一种实施方式中，所述阿魏酸和混合物的用量按其在反应体系中的投料质量比为1:10添加计算。
[0019]在一种实施方式中，所述催化反应在20～100mM的醋酸盐或PBS缓冲液(pH为5.0～7.0)中进行。
[0020]在一种实施方式中，所述催化反应在50mM pH6.0的PBS缓冲溶液。
[0021]在一种实施方式中，所述催化反应的温度为30～60℃。
[0022]在一种实施方式中，所述催化反应的温度为45℃。
[0023]在一种实施方式中，所述催化反应的时间为20～70h。
[0024]在一种实施方式中，所述催化反应的时间为为30h。
[0025]在一种实施方式中，所述催化反应的搅拌转速为200～400rpm。
[0026]在一种实施方式中，所述催化反应的搅拌转速为400rpm。
[0027]本专利技术的第二个目的是提供一种催化剂，所述催化剂包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的阿魏酸酯酶，或者携带核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的阿魏酸酯酶的微生物细胞。
[0028]在一种实施方式中，所述微生物细胞包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或毕赤酵母。
[0029]在一种实施方式中，所述微生物细胞为大肠杆菌。
[0030]在一种实施方式中，所述大肠杆菌包括大肠杆菌BL21(DE3)。
[0031]本专利技术还提供了所述方法或所述催化剂在制备水溶性阿魏酸衍生物的应用。
[0032]本专利技术的有益效果：本专利技术提供了一种生物酶催化制备水溶性阿魏酸衍生物的方法，将来源于Aspergillus niger中的阿魏酸酯酶FAE
‑
III基因faeA克隆至表达载体获得重组载体，并将所述重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3)获得重组细胞，并诱导表达重组酶阿魏酸酯酶FAE
‑
III；以该酶为催化介质，将阿魏酸、甘油和二甘油的混合物催化获得比阿魏酸更优的水溶解性衍生物阿魏酸甘油酯和阿魏酸二甘油酯(图1和图2)。本专利技术提供的方法在反应30h后，阿魏酸转化为阿魏酸甘油酯的转化率为58％，转化为阿魏酸二甘油酯的转化率为32％(图5)。
附图说明
[0033]图1：阿魏酸和甘油经阿魏酸酯酶FAE
‑
III催化为阿魏酸甘油酯的反应流程图，1为阿魏酸，2为甘油，3为阿魏酸甘油酯。
[0034]图2：阿魏酸和二甘油经阿魏酸酯酶FAE
‑
III催化为阿魏酸二甘油酯的反应流程图，1为阿魏酸，2为二甘油，3为阿魏酸二甘油酯。
[0035]图3：SDS
‑
PAGE凝胶电泳图。
[0036]图4：阿魏酸、阿魏酸甘油酯和阿魏酸二甘油酯HPLC色谱图及质谱图。峰1为阿魏酸，峰2为阿魏酸甘油酯，峰3为阿魏酸二甘油酯；A为HPLC色谱图，B为阿魏酸甘油酯质谱图，C为阿魏酸二甘油酯质谱图。
[0037]图5：阿魏酸甘油酯和阿魏酸二甘油酯产量随时间变化图。
具体实施方式
[0038]本专利技术公开了一种生物酶催化制备水溶性阿魏酸衍生物的方法，本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为本专利技术保护的范围。
[0039]本专利技术所述合成方法及其反应原理示意图旨在清楚的描述核心的反应路线，并不限制整个反应采用一步法还是多步法进行。
[0040]实施例1阿魏酸酯酶FAE
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III本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生物酶催化制备水溶性阿魏酸衍生物的方法，其特征在于，以含有甘油和/或二甘油的混合物以及阿魏酸为底物，加入阿魏酸酯酶进行催化反应，获得水溶性阿魏酸衍生物。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阿魏酸酯酶来源于Aspergillus niger。3.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述阿魏酸酯酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。4.根据权利要求1～3任一所述的方法，其特征在于，所述的阿魏酸酯酶以全细胞、粗酶液、纯酶或者固定化酶的形式发挥催化作用。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阿魏酸酯酶的用量按其在反应体系中的终含量为2U
‑
20U添加计算。6.根据权利要求1所述的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：张山，肖运柱，李志，
申请(专利权)人：深圳中科欣扬生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：