一种基于环化核酸适体的新型肝细胞生长因子模拟物及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种基于环化核酸适体的新型肝细胞生长因子模拟物及其制备方法和应用。本发明专利技术通过两条靶向肝细胞生长因子的单价核酸适体进行碱基互补配对杂交，并利用T4连接酶对杂交后的序列进行环化、进而利用核酸外切酶去除未环化序列，经纯化去除酶、无机盐离子等杂质，得到所述新型肝细胞生长因子模拟物。本发明专利技术通过体内外评价，证明了所述新型肝细胞生长因子模拟物的高稳定性及活性，其可活体应用，用于对乙酰氨基酚引起的小鼠急性肝损伤的修复治疗。本发明专利技术设计简单，易于操作，疗效明确。确。

【技术实现步骤摘要】
一种基于环化核酸适体的新型肝细胞生长因子模拟物及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物医药领域，特别涉及一种基于环化核酸适体的新型肝细胞生长因子模拟物及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]肝细胞生长因子（HGF）是一种具有多种生物学活性的细胞因子，其在肝脏再生中起关键作用，可通过与肝细胞膜上受体（Met）结合，启动促再生信号通路。研究表明，HGF具有抗肝损伤作用，对于对乙酰氨基酚，四氯化碳等引起的肝损伤具有保护和修复作用。由于HGF具备促细胞生存增殖活性，使用重组HGF（rHGF）作为治疗药物可用于肝脏疾病例如急性肝损伤，肝硬化等的治疗。然而，rHGF也具有一些固有的缺点，例如热稳定性低，不同批次间差异大、需要严格的质量控制，价格昂贵，具有免疫原性等。这些问题限制了rHGF在临床上的应用。 因此，合成新的HGF模拟物替代rHGF具有重要意义。
[0003]核酸适体是一种新型的分子识别工具， 也被称为“化学抗体”，其作为设计生长因子模拟物的化学分子具有很好的前景。核酸适体可通过固相合成技术合成，与重组蛋白的生物合成方法相比，批次稳定，更易大规模合成，成本更低。并且，核酸适体热变性可逆，具有更好的热稳定性。核酸适体还可通过简单设计，利用碱基互补配对，诱导靶受体二聚，从而模拟配体生长因子的作用激活该受体信号通路，作为生长因子的模拟物。然而，核酸适体在体内易被核酸酶降解，限制了基于核酸适体的生长因子模拟物在活体内的应用。核酸适体容易降解主要是由血液中的核酸外切酶引起。有研究表明，核酸通过连接酶连接 5
’
端和 3
’
端成环后，与线性核酸适体相比，由于缺少游离的末端，而可以很好避免被核酸外切酶降解。而核酸适体环化后，不仅可以提高其抗酶切能力，还可以由于限制了核酸适体的构像，增强其对靶标的亲和力，提高其在体内的性能，目前已广泛用于药物递送、免疫治疗等多个研究领域，但还未有研究用于制备生长因子模拟物。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种基于环化核酸适体的新型肝细胞生长因子（HGF）模拟物及其制备方法和应用。本专利技术的新型HGF模拟物是利用两条具有部分互补序列的靶向HGF受体 （Met）的单价核酸适体，通过互补杂交形成二价核酸适体，接着，利用T4连接酶连接二价核酸适体的5
’
端和 3
’
端，使其成环，进而得到环二价核酸适体，经过进一步的酶切及纯化，得到基于环化核酸适体的新型HGF模拟物。该新型HGF模拟物具有抗核酸外切酶能力，良好的血清稳定性，可用于由对乙酰氨基酚引起的小鼠急性肝损伤的治疗，并具有良好的治疗效果。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术首先提供了一种基于环化核酸适体的新型HGF模拟物的制备方法，利用两条具有靶向肝细胞生长因子受体的单价核酸适体通过杂交、环化、纯化制备得到具有类似
肝细胞生长因子作用的基于环化核酸适体的新型肝细胞生长因子模拟物。
[0006]进一步的，上述两条具有靶向HGF受体的单价核酸适体为Ap
‑
Met
‑
1、Ap
‑
Met
‑
2，单价核酸适体Ap
‑
Met
‑
1由靶标受体特异性核酸适体部分、第一连接部分、5
’
端磷酸化基团修饰部分和3
’
端羟基修饰部分组成，单价核酸适体Ap
‑
Met
‑
2由靶标受体特异性核酸适体部分、第二连接部分、5
’
端磷酸化基团修饰部分和3
’
端羟基修饰部分组成，单价核酸适体Ap
‑
Met
‑
1和单价核酸适体Ap
‑
Met
‑
2的靶标受体特异性核酸适体部分可与靶标HGF受体特异性结合；单价核酸适体Ap
‑
Met
‑
1的第一连接部分与单价核酸适体Ap
‑
Met
‑
2的第二连接部分可通过碱基互补配对形成连接结构；形成连接结构后加入T4连接酶，催化单价核酸适体Ap
‑
Met
‑
1的5
’
端磷酸化基团与单价核酸适体Ap
‑
Met
‑
2的3
’
端醇羟基形成磷酸二酯键，单价核酸适体Ap
‑
Met
‑
2的5
’
端磷酸化基团与单价核酸适体Ap
‑
Met
‑
1的3
’
端醇羟基形成磷酸二酯键，进而形成闭环的二价环化核酸适体。
[0007]进一步的，上述单价核酸适体Ap
‑
Met
‑
1、Ap
‑
Met
‑
2的序列为：Ap
‑
Met
‑
1：5
’‑
P
‑
ATCAGGCTGGATGGTAGCTCGGTCGGGGTGGGTGGGTTGGCAAGTCTGATCTGTAGAACGTTATCATA
‑
OH
‑3’
；Ap
‑
Met
‑
2：5
’‑
P
‑
ATCAGGCTGGATGGTAGCTCGGTCGGGGTGGGTGGGTTGGCAAGTCTGATTATGATAACGTTCTACAG
‑
OH
‑3’
。
[0008]进一步的，上述一种基于环化核酸适体的新型HGF模拟物的制备方法具体包括以下步骤：1）将单价核酸适体（Ap
‑
Met
‑
1和Ap
‑
Met
‑
2）干粉分别溶于默克水，配成100μM的母液；2）取12μl Ap
‑
Met
‑
1母液和12μl Ap
‑
Met
‑
2母液，分别加入到18μl含有3mM MgCl2的1
×
PBS缓冲液（PH=7.4）中充分混匀，配成40μM的Ap
‑
Met
‑
1溶液和40μM的Ap
‑
Met
‑
2溶液，置于金属浴95℃加热5min，然后在冰上放置半小时，接着将Ap
‑
Met
‑
1溶液和Ap
‑
Met
‑
2溶液按体积比1:1混合，室温震荡15min，得到二价核酸适体Ap
‑
Met
‑
1+2的溶液；3）将步骤2）所得二价核酸适体Ap
‑
Met
‑
1+2溶液取50μl ，与2μL 50u/μL T4连接酶、5.8μL 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于环化核酸适体的新型肝细胞生长因子模拟物的制备方法，其特征在于，利用两条具有靶向肝细胞生长因子受体的单价核酸适体通过杂交、环化、纯化制备得到具有类似肝细胞生长因子作用的基于环化核酸适体的新型肝细胞生长因子模拟物。2.根据权利要求1所述的基于环化核酸适体的新型肝细胞生长因子模拟物的制备方法，其特征在于，所述两条具有靶向肝细胞生长因子受体的单价核酸适体为Ap
‑
Met
‑
1、Ap
‑
Met
‑
2；所述单价核酸适体Ap
‑
Met
‑
1由靶标受体特异性核酸适体部分、第一连接部分、5
’
端磷酸化基团修饰部分和3
’
端羟基修饰部分组成，所述单价核酸适体Ap
‑
Met
‑
2由靶标受体特异性核酸适体部分、第二连接部分、5
’
端磷酸化基团修饰部分和3
’
端羟基修饰部分组成；所述单价核酸适体Ap
‑
Met
‑
1和单价核酸适体Ap
‑
Met
‑
2的靶标受体特异性核酸适体部分可与靶标肝细胞生长因子受体特异性结合；所述单价核酸适体Ap
‑
Met
‑
1的第一连接部分与单价核酸适体Ap
‑
Met
‑
2的第二连接部分可通过碱基互补配对形成连接结构。3.根据权利要求2所述的基于环化核酸适体的新型肝细胞生长因子模拟物的制备方法，其特征在于，所述单价核酸适体的序列为：Ap
‑
Met
‑
1：5
’‑
P
‑
ATCAGGCTGGATGGTAGCTCGGTCGGGGTGGGTGGGTTGGCAAGTCTGATCTGTAGAACGTTATCATA
‑
OH
‑3’
；Ap
‑
Met
‑
2：5
’‑
P
‑
ATCAGGCTGGATGGTAGCTCGGTCGGGGTGGGTGGGTTGGCAAGTCTGATTATGATAACGTTCTACAG
‑
OH
‑3’
。4.根据权利要求3所述的基于环化核酸适体的新型肝细胞生长因子模拟物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：1）分别将单价核酸适体Ap
‑
Met
‑
1和Ap
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁虹，陈珊，李婧影，杨黄浩，张晨，王宗华，
申请(专利权)人：福州大学，
类型：发明
国别省市：