一种生产β-烟酰胺单核苷酸的重组菌株及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种生产β

【技术实现步骤摘要】
一种生产
β
‑
烟酰胺单核苷酸的重组菌株及其应用


[0001]本专利技术属于微生物
，尤其涉及一种生产β
‑
烟酰胺单核苷酸的重组菌株及其应用。

技术介绍

[0002]烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide,NMNCAS:1094
‑
61
‑
7)，分子式 C11H15N2O8P，分子量334.22。NMN是一种广泛存在于生物体和自然界中的核苷酸，有α和β两种不同存在形式；β
‑
NMN是NMN的活性形式，因此，若非特别注明是α
‑
NMN，通常NMN指的是β
‑
NMN。
[0003]在哺乳动物体内，NMN是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD
+
)的关键合成前体。哺乳动物体内有三种途径合成NAD
+
，分别是从头合成途径、Preiss
‑
Handler途径和补救合成途径；其中补救合成途径是NAD
+
的主要合成途径。在补救合成途径中，烟酰胺(NAM)和磷酸核糖焦磷酸(PRPP)作为前体，通过烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt,EC2.4.2.12)催化合成NMN，NMN在烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶(Nmnat)催化下生成NAD。因此NMN是NAD
+
体内合成的关键前体，同时NMN通过转化为NAD
+
发挥相应的生理功能。提高体内NAD
+
含量可以改善线粒体产能和氧化还原代谢、激活NAD
+
依赖性酶、调节细胞存活和死亡、延长哺乳动物寿命等。NMN是NAD
+
合成途径中的重要中间体，也是通过转化为NAD
+
来实现其生理活性的。如图1所示，NAD
+
的体内合成途径主要有两种：从头合成途径和补救合成途径。从头合成途径以色氨酸(Tryptophan,Trp)作为前体，首先通过五步反应生成喹啉酸 (Quinolinicacid,QA)。生成的QA在喹啉酸转磷酸核糖基酶(QPRT)的催化下生成烟酸单核苷酸(NAMN)。QPRT是整个反应的限速酶，反应依赖三磷酸腺苷(ATP)，需要消耗镁离子和PRPP。NAMN经烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶(NMNAT)的催化作用生成烟酸腺嘌呤二核苷酸(NAAD)，最后NAAD经过NAD合成酶(NADS)的催化作用最终生成NAD
+
。NAD
+
的补救合成途径以NAM作为前体，通过两步反应合成NAD
+
。NMN是NAD
+
的补救合成途径中的重要中间物质。首先，NAM通过烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt,EC2.4.2.12)催化合成NMN，这一步反应需要消耗ATP和PRPP；其次，NMN通过NMN消耗酶(NMNATs)催化合成NAD
+
，消耗一个ATP。近期的研究发现，提高患者体内NMN含量在改善糖尿病、增加胰岛对血糖的敏感性、恢复心脏收缩功能、改善阿尔兹海默症带来的认知障碍、改善抑郁、对脑出血引发的继发性脑损伤有保护作用、提高帕金森患者的存活率、改善老龄化疾病等方面都有作用。
[0004]目前NMN的制备方法分为化学合成法、酶合成法和微生物发酵合成法，其中以化学合成法为主。化学合成法的原料可以是烟酰胺、烟酰胺核糖、辅酶I或是四乙酰核糖。这些化学合成方法个别原料价格昂贵、获得困难；路程长、异构体和杂质分离困难；环保方面投入成本大；最重要的是目前中国申请新食品原料原则上不推荐化学工艺制备而来的原料。因此限制了用化学合成法大规模生产NMN的可能。酶合成法有两种技术路线。一是以D－5－磷酸核糖和烟酰胺为原料，通过固定化含有磷酸核糖焦磷酸合成酶(PRPPS) 和烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)的全细胞催化合成β
‑
NMN；二是以ATP与烟酰胺核糖为原料，在烟酰胺核糖
苷激酶(NRK)作用下生成NMN。两种方法原料中的D
‑5‑
磷酸核糖和ATP 造价昂贵，且现有的Nampt和NRK两种酶的酶活性较低，使得酶合成法存在耗时长、成本高、收率低等问题，限制了大规模应用。生物发酵法生产NMN，主要是利用微生物菌株自身的生物合成途径来生产NMN，可以克服酶法生产中原料昂贵的限制因素，但是现有的微生物发酵合成法存在β
‑
烟酰胺单核苷酸产量低、生产效率低等缺陷。
[0005]大肠杆菌由于具有遗传背景清楚、技术操作简单、培养条件简单、大规模发酵经济等优点，所以倍受遗传工程专家的重视。但是，大肠杆菌中没有烟酰胺磷酸核糖转移酶，无法将NAM合成NMN。再者，由于外源基因的引入可能会导致菌株的生长状态不稳定，限制了进一步的应用。

技术实现思路

[0006]鉴于现有技术所存在的问题，本专利技术提供一种生产β
‑
烟酰胺单核苷酸的重组菌株及其应用。本专利技术提供的重组菌株可以用于生产β
‑
烟酰胺单核苷酸，具有β
‑
烟酰胺单核苷酸产量高等优点。
[0007]本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：
[0008]本专利技术提供一种生产β
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烟酰胺单核苷酸的重组菌株，所述重组菌株为大肠杆菌，所述重组菌株表达烟酰胺核糖转移酶基因。
[0009]优选地，所述重组菌株过量表达烟酰胺核糖转移酶基因。本专利技术对于过量表达烟酰胺核糖转移酶基因的方法没有特殊限制，可以构建含有烟酰胺核糖转移酶基因的载体，也可以在菌株的基因组上插入烟酰胺核糖转移酶基因。为了满足表达需要，所述重组菌株还可以包括与表达烟酰胺核糖转移酶基因相关的元件，例如，基本骨架、抗性基因标记、操纵子等。
[0010]所述烟酰胺核糖转移酶基因可以选自Homo sapiens来源HsnadV(NP_005737.1)、 Chitinophaga pinensis来源的CpnadV(WP_012788281.1)、Haemophilus ducreyi来源的HdnadV(NP_957670.1)以及Meiothermus ruber来源的RnnadV(ADD29592.1)基因中的一种或几种。
[0011]优选地，分别对HsnadV、CpnadV、HdnadV和RnnadV基因的序列进行优化，优化后的HsnadV的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，优化后的CpnadV的核苷酸序列如SEQID NO:2所示，优化后的HdnadV的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，优化后的RnnadV的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
[0012]采取上述技术方案的有益效果包括：本专利技术筛选了很多不同来源的烟酰胺核糖转移酶，意外的发现采用上述四种烟酰胺核糖转移酶可以生产β
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烟酰胺单核苷酸，尤其选择 Chitinophaga pinensis来源的CpnadV可以获得更高产量的β
‑<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生产β
‑
烟酰胺单核苷酸的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为大肠杆菌，所述重组菌株表达烟酰胺核糖转移酶基因。2.根据权利要求1所述重组菌株，其特征在于，含有至少一个用于表达烟酰胺核糖转移酶基因的启动子。3.根据权利要求1或2所述重组菌株，其特征在于，所述烟酰胺核糖转移酶基因选自HsnadV、CpnadV、HdnadV、RnnadV基因中的一种或几种。4.根据权利要求1或2所述重组菌株，其特征在于，所述启动子选自ppheL、pyhjX、pompG、pumuD、pygdI、placI、pbhsA、phemP、parfA、phokD、ptonB、ppdhR、pcysK中的一种或几种的组合。5.根据权利要求1或2所述重组菌株，其特征在于，重组菌株名称为大肠埃希氏菌nadVcp24(Escherichia coli nadVcp24),保藏编号为CGMCC No.25415。6.一种权利要求1
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5任一项所述重组菌株的制备方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：程永强，高煦丹，唐宁，张晓军，翟竟媛，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：