一株产L-异亮氨酸的谷氨酸棒状杆菌工程菌制造技术

本发明专利技术涉及一株产L‑异亮氨酸的谷氨酸棒状杆菌工程菌，属于基因工程和发酵工程技术领域。该菌株以L‑异亮氨酸工业生产菌WM001为基础，通过基因敲除、过表达等手段对其L‑异亮氨酸合成代谢途径进行改造，最终得到的菌株WM005/pYCW‑1‑ilvBN‑ppnK能够稳定遗传，且在制备L‑异亮氨酸过程中无需添加抗生素，减少了产生耐药性菌株的风险，制备得到的L‑异亮氨酸适合医疗、化妆品、工业等各个领域的生产，不会因为抗生素而造成产品的污染；在5L发酵罐补料分批发酵中积累32.1g/L的L‑异亮氨酸，糖酸转化率达到0.181g/g，适用于L‑异亮氨酸的工业化生产。

An engineering strain of Corynebacterium glutamicum producing L-isoleucine

【技术实现步骤摘要】
一株产L-异亮氨酸的谷氨酸棒状杆菌工程菌
本专利技术构建一株产L-异亮氨酸的谷氨酸棒状杆菌工程菌，属于基因工程和发酵工程

技术介绍
L-异亮氨酸是人体必需的三种支链氨基酸(BCAA)之一，在各种工业应用中用于生产各种产品，例如人类营养增强剂，动物饲料添加剂，医疗产品成分和化妆品成分。L-异亮氨酸主要通过微生物发酵生产，而大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌是主要的生产菌株。但是，大肠杆菌通常会合成内毒素，这可能会污染产品。因此，谷氨酸棒状杆菌成为生产L-异亮氨酸的理想菌株。在谷氨酸棒状杆菌中，由于L-异亮氨酸与其他氨基酸相互交织合成：从L-天冬氨酸开始，由十个反应步骤组成的L-异亮氨酸生物合成途径是复杂的。因此，L-异亮氨酸的生产是比较困难的。L-异亮氨酸生物合成途径中有十种关键酶分别为天冬氨酸激酶(AK)，半醛脱氢酶(ASD)，高丝氨酸脱氢酶(HD)，高丝氨酸激酶(HK)，苏氨酸合酶(TS)，苏氨酸脱水酶(TD)，乙酰羟酸合酶(AHAS)，乙酰羟酸异构酶(AHAIR)，羟酸脱水酶(DHAD)和支链氨基酸转氨酶(TA)，它们分别由基因ly本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生产L-异亮氨酸谷氨酸棒状杆菌的工程菌的制备方法，其特征在于，所述方法是将L-异亮氨酸工业生产菌WM001的启动子ilvA替换为启动子tac，敲除基因alaT、brnQ，在此基础上敲除alr基因获得构建营养缺陷型系统，在该系统中回补alr基因并过表达基因ilvBN和ppnK。/n

【技术特征摘要】
1.一种生产L-异亮氨酸谷氨酸棒状杆菌的工程菌的制备方法，其特征在于，所述方法是将L-异亮氨酸工业生产菌WM001的启动子ilvA替换为启动子tac，敲除基因alaT、brnQ，在此基础上敲除alr基因获得构建营养缺陷型系统，在该系统中回补alr基因并过表达基因ilvBN和ppnK。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，扩增出启动子tac片段和启动子ilvA的上下游片段，构建得到包含启动子tac的载体，再将所述载体转入WM001中，得到含启动子tac的菌株。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，按照下述步骤敲除基因alaT：扩增如SEQIDNO.4、SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示的片段，将扩增的片段经酶切后连接至线性化载体，得到alaT基因敲除载体，将所述alaT基因敲除载体转入权利要求2所述含启动子tac的菌株，得到alaT基因敲除菌株；
按照下述步骤敲除基因brnQ：扩增出如SEQIDNO.4、SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示的片段，将扩增的片段经酶切后连接至线性化载体得到brnQ基因敲除载体，再将所述brnQ基因敲除载体转入所述alaT基因敲除菌株中，得到alaT和brnQ双基因敲除菌株。
按照下述步骤敲除基因alr：扩增出如SEQIDNO.4、SEQIDNO.9和SEQIDNO.10所示的片段，将扩增的片段经酶切后连接至线性化载体得到alr基因敲除载体，再将所述alr基因敲除载体转入所述alaT和...

【专利技术属性】
技术研发人员：王小元，张炎潮，柳亚迪，胡晓清，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32