一株产L-异亮氨酸的谷氨酸棒状杆菌工程菌制造技术

本发明专利技术涉及一株产L‑异亮氨酸的谷氨酸棒状杆菌工程菌，属于基因工程和发酵工程技术领域。该菌株以L‑异亮氨酸工业生产菌WM001为基础，通过基因敲除、过表达等手段对其L‑异亮氨酸合成代谢途径进行改造，最终得到的菌株WM005/pYCW‑1‑ilvBN‑ppnK能够稳定遗传，且在制备L‑异亮氨酸过程中无需添加抗生素，减少了产生耐药性菌株的风险，制备得到的L‑异亮氨酸适合医疗、化妆品、工业等各个领域的生产，不会因为抗生素而造成产品的污染；在5L发酵罐补料分批发酵中积累32.1g/L的L‑异亮氨酸，糖酸转化率达到0.181g/g，适用于L‑异亮氨酸的工业化生产。

An engineering strain of Corynebacterium glutamicum producing L-isoleucine

【技术实现步骤摘要】
一株产L-异亮氨酸的谷氨酸棒状杆菌工程菌
本专利技术构建一株产L-异亮氨酸的谷氨酸棒状杆菌工程菌，属于基因工程和发酵工程

技术介绍
L-异亮氨酸是人体必需的三种支链氨基酸(BCAA)之一，在各种工业应用中用于生产各种产品，例如人类营养增强剂，动物饲料添加剂，医疗产品成分和化妆品成分。L-异亮氨酸主要通过微生物发酵生产，而大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌是主要的生产菌株。但是，大肠杆菌通常会合成内毒素，这可能会污染产品。因此，谷氨酸棒状杆菌成为生产L-异亮氨酸的理想菌株。在谷氨酸棒状杆菌中，由于L-异亮氨酸与其他氨基酸相互交织合成：从L-天冬氨酸开始，由十个反应步骤组成的L-异亮氨酸生物合成途径是复杂的。因此，L-异亮氨酸的生产是比较困难的。L-异亮氨酸生物合成途径中有十种关键酶分别为天冬氨酸激酶(AK)，半醛脱氢酶(ASD)，高丝氨酸脱氢酶(HD)，高丝氨酸激酶(HK)，苏氨酸合酶(TS)，苏氨酸脱水酶(TD)，乙酰羟酸合酶(AHAS)，乙酰羟酸异构酶(AHAIR)，羟酸脱水酶(DHAD)和支链氨基酸转氨酶(TA)，它们分别由基因lysC，asd，hom，thrB，thrC，ilvA，ilvBN，ilvC，ilvD和ilvE编码。从理论上讲，TD(ilvA基因编码)和AHAS(ilvBN基因编码)在这些酶中更为重要，TD催化形成L-异亮氨酸生物合成的关键前体物质——2-酮丁酸；AHAS在平衡谷氨酸棒状杆菌细胞中L-缬氨酸和L-异亮氨酸的水平方面起着重要作用，它可以催化两个丙酮酸分子的缩合，导致L-缬氨酸的合成，或者丙酮酸和2-酮丁酸的缩合，导致L-异亮氨酸合成。实验室早期研究，已经通过质粒载体过表达lrp，brnFE，ilvBN，ilvA和ppnK来构建生产L-异亮氨酸的谷氨酸棒状杆菌菌株，但在发酵过程中必须添加抗生素如卡那霉素，维持带有这些基因的质粒。参考以下文章：1.YinL,HuX,WangX,etal.Co-xpressionoffeedback-resistantthreoninedehydrataseandacetohydroxyacidsynthaseincreasesL-isoleucineproductioninCorynebacteriumglutamicum.2012,MetabEng2.YinL,ShiF,WangXetal.IncreasingL-isoleucineproductioninCorynebacteriumglutamicumbyoverexpressingglobalregulatorLrpandtwo-componentexportsystemBrnFE.2013,JApplMicrobiol3.YinL,ZhaoJ,WangX,etaLIncreasingL-isoleucineproductioninCorynebacteriumglutamicumbyenhancingthecarbonfluxinitsbiosynthesispathwayandNADPHsupply.2013,BioprocBiotechnolEngineer为了构建一株不依赖抗生素且能进行过表达特定基因的菌株，本专利技术采用了构建营养缺陷型菌株的方法。基因alr编码丙氨酸消旋酶，丙氨酸消旋酶能将L-丙氨酸转化为D-丙氨酸，D-丙氨酸是形成谷氨酸棒状杆菌的肽聚糖层的关键前体。因此，基因alr被用于构建谷氨酸棒状杆菌中的营养缺陷型互补表达系统。敲除alr后，菌株由于无法自身合成D-丙氨酸，需要补加D-丙氨酸才能存活，因而构建得到一株D-丙氨酸缺陷型菌株，后将alr与需要过表达的基因进行串联转入缺陷型菌株中，用于筛选得到不添加抗生素的菌株。实验室前期通过强化碳流和提高NADPH供应，获得最优表达组合菌株IWJ001/pDXW-8-ilvBN1-ilvA1-ppnK1积累了高水平的L-异亮氨酸。(YinL,ZhaoJ,WangX,etaLIncreasingL-isoleucineproductioninCorynebacteriumglutamicumbyenhancingthecarbonfluxinitsbiosynthesispathwayandNADPHsupply.2013,BioprocBiotechnolEngineer)在基于alr的营养缺陷型互补表达系统的基础上，过表达ilvBN可以增强碳流和过表达ppnK可以增加辅酶因子NADPH供应，从而提高L-异亮氨酸的产量。近些年来，一些代谢工程策略用于改造谷氨酸棒状杆菌生产L-异亮氨酸的研究已被报道，通过敲除基因alaT可以减少主要杂酸L-丙氨酸和增加丙酮酸前体物质供应(alaT可以将丙酮酸转换成L-丙氨酸，而L-丙氨酸是L-异亮氨酸生产的主要杂酸；减少L-丙氨酸同时增加胞内的-丙酮酸，丙酮酸也是前体物质)，通过敲除brnQ可以避免L-异亮氨酸的主动输入(brnQ基因是将L-异亮氨酸从胞外摄取到胞内的关键基因，敲除后可使胞外L-异亮氨酸含量更高)，有利于谷氨酸棒状杆菌的L-异亮氨酸生产。但是尚无报道结合多种策略于改造谷氨酸棒状杆菌生产L-异亮氨酸。此外，通过强启动子替换过表达ilvA可以增加2-酮丁酸前体物质供应。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一株通过启动子替换、基因敲除和基于alr的营养缺陷型互补表达系统，运用多种代谢工程策略，最终构建无需添加抗生素的高产L-异亮氨酸谷氨酸棒状杆菌工程菌。本专利技术提供了一株生产L-异亮氨酸谷氨酸棒状杆菌的工程菌WM005/pYCW-1-ilvBN-ppnK，所述工程菌是以菌株WM001为出发菌株，所述菌株WM001是一株由ATCC13869随机诱变得到的L-异亮氨酸工业生产菌，构建方法记载于WenjianM,JianliW,YeL,etal.Poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate)co-producedwithl-isoleucineinCorynebacteriumglutamicumWM001[J].MicrobialCellFactories,2018,17(1):93。一种生产L-异亮氨酸谷氨酸棒状杆菌的工程菌WM005/pYCW-1-ilvBN-ppnK的制备方法，所述方法是将L-异亮氨酸工业生产菌WM001的启动子ilvA替换为启动子tac，敲除基因alaT、brnQ，在此基础上敲除alr基因获得构建营养缺陷型系统，在该系统中回补alr基因并过表达基因ilvBN和ppnK。在本专利技术的一种实施方式中，先扩增出启动子tac片段和启动子ilvA的上下游片段，构建得到包含启动子tac的载体，再将所述载体转入WM001中，得到含启动子tac的菌株WM002。在本专利技术的一种实施方式中，所述包含启动子tac的载体是在载体pDXW-3的基础上，将ilvA启动子替换为tac启动子的片段连接，得到载体pYCW-tacPilvA。在本专利技术的一种实施方式中，所述载体pDXW-3的构建方法本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生产L-异亮氨酸谷氨酸棒状杆菌的工程菌的制备方法，其特征在于，所述方法是将L-异亮氨酸工业生产菌WM001的启动子ilvA替换为启动子tac，敲除基因alaT、brnQ，在此基础上敲除alr基因获得构建营养缺陷型系统，在该系统中回补alr基因并过表达基因ilvBN和ppnK。/n

【技术特征摘要】
1.一种生产L-异亮氨酸谷氨酸棒状杆菌的工程菌的制备方法，其特征在于，所述方法是将L-异亮氨酸工业生产菌WM001的启动子ilvA替换为启动子tac，敲除基因alaT、brnQ，在此基础上敲除alr基因获得构建营养缺陷型系统，在该系统中回补alr基因并过表达基因ilvBN和ppnK。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，扩增出启动子tac片段和启动子ilvA的上下游片段，构建得到包含启动子tac的载体，再将所述载体转入WM001中，得到含启动子tac的菌株。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，按照下述步骤敲除基因alaT：扩增如SEQIDNO.4、SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示的片段，将扩增的片段经酶切后连接至线性化载体，得到alaT基因敲除载体，将所述alaT基因敲除载体转入权利要求2所述含启动子tac的菌株，得到alaT基因敲除菌株；
按照下述步骤敲除基因brnQ：扩增出如SEQIDNO.4、SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示的片段，将扩增的片段经酶切后连接至线性化载体得到brnQ基因敲除载体，再将所述brnQ基因敲除载体转入所述alaT基因敲除菌株中，得到alaT和brnQ双基因敲除菌株。
按照下述步骤敲除基因alr：扩增出如SEQIDNO.4、SEQIDNO.9和SEQIDNO.10所示的片段，将扩增的片段经酶切后连接至线性化载体得到alr基因敲除载体，再将所述alr基因敲除载体转入所述alaT和...

【专利技术属性】
技术研发人员：王小元，张炎潮，柳亚迪，胡晓清，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32