一种利用CRISPR-Cas9技术敲除大肠杆菌中胞苷脱氨酶基因cdd的方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种利用CRISPR‑Cas9技术敲除大肠杆菌中胞苷脱氨酶基因cdd的方法及应用。包括以下步骤：1制作含有Cas9质粒的大肠杆菌BL21（DE3）感受态；2、设计合成突变sgRNA；3、构建Donor DNA；4、将sgRNA质粒与Donor DNA采用电转化法转化至携带Cas9质粒的大肠杆菌感受态中，敲除cdd基因；5、将目标质粒pET28a‑UCK导入敲除菌株生产胞苷酸；本发明专利技术具有操作简便、cdd基因敲除成功率高且敲除菌株对底物转化率提高，适合工业化生产胞苷酸等优点。敲除菌株生产胞苷酸相较于未敲除菌株，其对底物胞苷以及ATP的转化率提高了15%，达到99%。

A method to knock out CDD of cytidine deaminase gene in Escherichia coli by crispr-cas9 technology and its application

【技术实现步骤摘要】
一种利用CRISPR-Cas9技术敲除大肠杆菌中胞苷脱氨酶基因cdd的方法及应用
本专利技术属于微生物基因工程
，具体涉及一种利用CRISPR-Cas9技术敲除大肠杆菌中胞苷脱氨酶基因cdd的方法及应用。
技术介绍
CRISPR-Cas系统是一种细菌的免疫防御系统，由细菌在长期抵御外源DNA的过程中进化而形成，能够降解入侵的外源DNA(病毒或噬菌体等)，广泛存在于细菌和古细菌中。CRISPR-Cas系统划分为三种类型：I型、II型和III型，其核心蛋白分别是Cas3、Cas9和Cas10。相对于I型和III型系统需要多种Cas蛋白参与反应，并且构成比较复杂的复合体，II型系统研究最为彻底，只需一个Cas9蛋白即能切割目的基因DNA。II型CRISPR-Cas9系统在目前基因编辑方面应用最为广泛。该系统主要由三部分组成：起靶向目的序列的crRNA、能够和crRNA配对连接的tracrRNA以及酶切目的序列的Cas9蛋白。CRISPR序列转录成熟的crRNA与tracrRNA通过碱基互补配对，形成部分具有双链的RNA结构，进而和Cas9蛋白形成复合体，剪切外源DNA。研究者将crRNA和tracrRNA整合在同一条单链中，设计出了长度为20bp左右的单链引导RNA(singleguideRNA，sgRNA)，sgRNA有两个功能，即可以与目的DNA序列互补配对，同时引导Cas9蛋白，实现基因的敲除等功能。近年来，CRISPR-Cas9技术已经广泛应用于微生物的基因组编辑和功能研究，尤其在细菌的基因编辑方面，取得了很大的进展。5’-胞苷酸（Cytidine5’-Monophosphate）别名：阿糖胞苷5`-单磷酸盐；单磷酸阿糖胞苷等，其多为白色或类白色结晶粉末，溶于水，不溶于乙醇。5’-胞苷酸为生物细胞内重要的生化物质，参与多种生理生化反应。工业上，5’-胞苷酸主要用于制造胞二磷胆碱、胞苷三磷酸、阿糖胞苷、聚肌胞等药物。近年来，亦可与其它核苷酸配合添加奶粉中，以增强婴儿的免疫力。5’-胞苷酸主要有两种生产方式，1）从RNA（核糖核酸）降解，然后经分离得到；2）从胞苷出发，用化学法在其5’位接上磷酸集团，形成5’-胞苷酸。第一种方法虽然一次可以得到四种产物，但除了胞苷酸之外，其它三种均成为副产物，再者RNA来源所受限制较多，且生产工艺中分离操作复杂，收率低；目前工业上合成5’-胞苷酸主要使用化学法，该方法主要缺点在于三废较多，腐蚀设备且不利于人员身体健康及工业化生产。针对现有技术不足，我们专利技术了一种高产胞苷酸的重组大肠杆菌BL21(DE3)-pET28a-UCK，该方法催化合成周期短，成本低。然而发酵生产经液相检测有副产物尿苷酸生产，通过查阅我们得知为胞苷脱氨酶基因cdd使底物胞苷转化为尿苷，经胞苷激酶转化为尿苷酸。从5’-胞苷酸行业的需求来看，虽然产量稳定增加，但是其副产物得产生影响了底物的高效利用。因此基因工程菌高产胞苷酸的改造成为生产应用中的重中之重。
技术实现思路
针对现有不足，本专利技术的目的在于一种利用CRISPR-Cas9技术敲除大肠杆菌中胞苷脱氨酶基因cdd的方法及应用。为了解决上述技术问题，本专利技术具体通过以下技术方案实现：一种利用CRISPR-Cas9技术敲除大肠杆菌中胞苷脱氨酶基因cdd的方法，包括以下步骤：步骤1，制作含有Cas9质粒的大肠杆菌BL21（DE3）感受态；步骤2，设计合成突变sgRNA；步骤3，构建DonorDNA；步骤4，将sgRNA质粒与DonorDNA采用电转化法转化至携带Cas9质粒的大肠杆菌感受态中，敲除cdd基因，即得敲除cdd基因的大肠杆菌。作为改进的是，步骤2中设计合成突变sgRNA时，选用的N20靶位点的核苷酸序列如SEQIDNO.1。作为改进的是，步骤2中设计合成突变sgRNA的两条引物序列如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示。作为改进的是，步骤3中DonorDNA的序列为SEQIDNO.4。上述敲除cdd基因的大肠杆菌在产胞苷酸上的应用，包括以下步骤：第一步，将目标质粒pET28a-UCK导入敲除菌株得到重组菌株BL21(DE3)-1-pET28a-UCK；第二步，培养重组菌株BL21(DE3)-1-pET28a-UCK至OD600至0.5~0.7时，加入IPTG至终浓度0.5‰~1‰，20~30℃下诱导表达13~15h后破碎，收集上清液即粗酶液，并测蛋白浓度；第三步，向蛋白浓度为6~8g/L的胞苷激酶粗酶液中加入浓度为30~35mM胞苷、30~35mM的三磷酸腺苷、8~10mMMgCl2、磷酸钾缓冲液，搅拌均匀后在pH7.5~8.0、35~37℃条件下反应7~9h，完成酶促反应合成胞苷酸。有益效果：与现有技术相比，本专利技术一种利用CRISPR-Cas9技术敲除大肠杆菌中胞苷脱氨酶基因cdd的方法及应用的优势如下：1、本专利技术敲除大肠杆菌基因的方法简单，效率高，成本低。2、通过chopchop网站选择了胞苷脱氨酶基因cddPAM区在第399位作为N20靶位点，其识别效率最高，能够更好的帮助pCas9质粒进行切割，提高敲除效率。3、敲除cdd基因，使大肠杆菌高效的利用胞苷产胞苷酸，提高了重组菌株对底物的利用率。敲除菌株生产胞苷酸相较于未敲除菌株，其对底物胞苷以及ATP的转化率提高了15%，达到99%。附图说明图1为重组菌株BL21(DE3)-pCas9的平板形态；图2为突变sgRNA电泳图，其中泳道1为Marker，泳道2～3为sgRNA突变图；图3为构建DonorDNA上下同源臂电泳图，其中泳道1为Marker，泳道2～3下同源臂，4~5为上同源臂；图4为DonorDNA电泳图，其中泳道1为Marker，泳道2～3为DonorDNA；图5为敲除后菌落PCR验证电泳图，其中泳道1为Marker，泳道2～9为敲除对应基因后片段大小。图6为敲除后菌株与未敲除菌株生产胞苷酸的对比。图7为检测到产物液相色谱图。具体实施方式下面将结合本专利技术具体的实施例，对本专利技术技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本实验中大肠杆菌Trans1-T1，大肠杆菌BL21(DE3)，质粒pCas9、sgRNA均为商业化物品，可以常规购买。实施例1制作含有Cas9质粒目的菌株且含有cdd基因的大肠杆菌感受态1、将质粒pCas9电转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态中，用卡那抗性筛选出目的菌株将2~5μg实验室库存的质粒pCas9加入到20~30μL实验室库存大肠杆菌BL21(DE3)感受态，冰上预冷2~5min；加入预冷的电转杯，条件为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用CRISPR-Cas9技术敲除大肠杆菌中胞苷脱氨酶基因cdd的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n步骤1，制作含有Cas9质粒的大肠杆菌BL21（DE3）感受态；/n步骤2，设计合成突变sgRNA；/n步骤3，构建Donor DNA；/n步骤4，将sgRNA质粒与Donor DNA采用电转化法转化至携带Cas9质粒的大肠杆菌感受态中，敲除cdd基因，即得敲除cdd基因的大肠杆菌。/n

【技术特征摘要】
1.一种利用CRISPR-Cas9技术敲除大肠杆菌中胞苷脱氨酶基因cdd的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，制作含有Cas9质粒的大肠杆菌BL21（DE3）感受态；
步骤2，设计合成突变sgRNA；
步骤3，构建DonorDNA；
步骤4，将sgRNA质粒与DonorDNA采用电转化法转化至携带Cas9质粒的大肠杆菌感受态中，敲除cdd基因，即得敲除cdd基因的大肠杆菌。


2.根据权利要求1所述的利用CRISPR-Cas9技术敲除大肠杆菌中胞苷脱氨酶基因cdd的方法，其特征在于，步骤2中设计合成突变sgRNA时，选用的N20靶位点的核苷酸序列如SEQIDNO.1。


3.根据权利要求1所述的利用CRISPR-Cas9技术敲除大肠杆菌中胞苷脱氨酶基因cdd的方法，其特征在于，步骤2中设计合成突变sgRNA的两条引物序列如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示。

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【专利技术属性】
技术研发人员：王昕，王静，陈可泉，马琛，秦航，欧阳平凯，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32