一种利用CRISPR-Cas9技术敲除大肠杆菌中胞苷脱氨酶基因cdd的方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种利用CRISPR‑Cas9技术敲除大肠杆菌中胞苷脱氨酶基因cdd的方法及应用。包括以下步骤：1制作含有Cas9质粒的大肠杆菌BL21（DE3）感受态；2、设计合成突变sgRNA；3、构建Donor DNA；4、将sgRNA质粒与Donor DNA采用电转化法转化至携带Cas9质粒的大肠杆菌感受态中，敲除cdd基因；5、将目标质粒pET28a‑UCK导入敲除菌株生产胞苷酸；本发明专利技术具有操作简便、cdd基因敲除成功率高且敲除菌株对底物转化率提高，适合工业化生产胞苷酸等优点。敲除菌株生产胞苷酸相较于未敲除菌株，其对底物胞苷以及ATP的转化率提高了15%，达到99%。

A method to knock out CDD of cytidine deaminase gene in Escherichia coli by crispr-cas9 technology and its application

【技术实现步骤摘要】
一种利用CRISPR-Cas9技术敲除大肠杆菌中胞苷脱氨酶基因cdd的方法及应用
本专利技术属于微生物基因工程
，具体涉及一种利用CRISPR-Cas9技术敲除大肠杆菌中胞苷脱氨酶基因cdd的方法及应用。
技术介绍
CRISPR-Cas系统是一种细菌的免疫防御系统，由细菌在长期抵御外源DNA的过程中进化而形成，能够降解入侵的外源DNA(病毒或噬菌体等)，广泛存在于细菌和古细菌中。CRISPR-Cas系统划分为三种类型：I型、II型和III型，其核心蛋白分别是Cas3、Cas9和Cas10。相对于I型和III型系统需要多种Cas蛋白参与反应，并且构成比较复杂的复合体，II型系统研究最为彻底，只需一个Cas9蛋白即能切割目的基因DNA。II型CRISPR-Cas9系统在目前基因编辑方面应用最为广泛。该系统主要由三部分组成：起靶向目的序列的crRNA、能够和crRNA配对连接的tracrRNA以及酶切目的序列的Cas9蛋白。CRISPR序列转录成熟的crRNA与tracrRNA通过碱基互补配对，形成部分具有双链的RNA结构，进而和Cas本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用CRISPR-Cas9技术敲除大肠杆菌中胞苷脱氨酶基因cdd的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n步骤1，制作含有Cas9质粒的大肠杆菌BL21（DE3）感受态；/n步骤2，设计合成突变sgRNA；/n步骤3，构建Donor DNA；/n步骤4，将sgRNA质粒与Donor DNA采用电转化法转化至携带Cas9质粒的大肠杆菌感受态中，敲除cdd基因，即得敲除cdd基因的大肠杆菌。/n

【技术特征摘要】
1.一种利用CRISPR-Cas9技术敲除大肠杆菌中胞苷脱氨酶基因cdd的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，制作含有Cas9质粒的大肠杆菌BL21（DE3）感受态；
步骤2，设计合成突变sgRNA；
步骤3，构建DonorDNA；
步骤4，将sgRNA质粒与DonorDNA采用电转化法转化至携带Cas9质粒的大肠杆菌感受态中，敲除cdd基因，即得敲除cdd基因的大肠杆菌。


2.根据权利要求1所述的利用CRISPR-Cas9技术敲除大肠杆菌中胞苷脱氨酶基因cdd的方法，其特征在于，步骤2中设计合成突变sgRNA时，选用的N20靶位点的核苷酸序列如SEQIDNO.1。


3.根据权利要求1所述的利用CRISPR-Cas9技术敲除大肠杆菌中胞苷脱氨酶基因cdd的方法，其特征在于，步骤2中设计合成突变sgRNA的两条引物序列如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示。

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【专利技术属性】
技术研发人员：王昕，王静，陈可泉，马琛，秦航，欧阳平凯，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32