一种生产L-组氨酸的基因工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种生产L‑组氨酸的基因工程菌及其应用，该菌是在大肠杆菌的基因组上整合了核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的谷氨酸棒杆菌ATP转磷酸核糖基酶HisG突变体编码基因hisG

A genetically engineered strain for L-histidine production and its application

【技术实现步骤摘要】
一种生产L-组氨酸的基因工程菌及其应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种生产L-组氨酸的基因工程菌及其构建方法和应用。
技术介绍
L-组氨酸(以下简称“组氨酸”)是一种重要的功能氨基酸，参与机体发育，抗氧化和免疫调节等多种生理生化过程。其主要应用于食品、饲料和医药行业，可作为营养强化剂和饲料添加剂以及用于生产氨基酸输液及综合氨基酸制剂，辅助治疗心脏病，贫血和胃肠溃疡等疾病，具有很高的经济和社会价值。目前组氨酸主要通过从蛋白水解液中提取的方法生产，但此法损失率高，设备腐蚀严重，分离成本高，并不是最佳的组氨酸生产方法。微生物发酵法生产组氨酸，原料成本低廉，环境友好，操作简单，周期短，适合工业化生产，成为当前组氨酸生产研究的热点。微生物发酵法生产组氨酸的瓶颈在于缺乏高效生产组氨酸的菌株，主要原因在于组氨酸的生物合成途径长，且受到严谨复杂的反馈调控；需要多种前提物的协调供应，特别是大量的能量供应，造成了菌体难以大量积累组氨酸。为了获得高产组氨酸的生产菌株，研究者运用多种技术手段，包括传统诱变筛选、基因工程、代谢工程等，改造了不同种属的菌株并取得了一系列的成果。虽然这些研究所用技术手段不同，但是方法策略大体如下：解除组氨酸合成途径所受的反馈抑制；增强组氨酸的合成途径；增加前体物的供应；阻断组氨酸的代谢途径；以及促进组氨酸向胞外分泌等。目前所报道的组氨酸发酵水平最高的菌株是E.coliWHY3(CN110184230A)，该菌是以E.coliW3110为出发菌株，通过解除组氨酸合成的反馈调控，增强组氨酸合成途径以及促进组氨酸的胞外分泌三个方面入手构建而成，其在5L发酵罐发酵40-50h可生产组氨酸40-55g/L，平均生产强度为1.0-1.5g/(L×h)，转化率为0.18-0.22g组氨酸/g葡萄糖。但是其组氨酸产量及转化率仍有很大的提升空间。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术目的是提供一种提高组氨酸发酵产量的方法，并且提供一株新的组氨酸发酵生产菌株。本专利技术技术方案概述如下：本专利技术提供一株高产L-组氨酸的基因工程菌E.coliWHY3-1，该菌是在大肠杆菌的基因组上整合了核苷酸序列如SEQIDNO:1所示的谷氨酸棒杆菌ATP转磷酸核糖基酶HisG突变体编码基因hisG*并使其强表达，以增强组氨酸合成关键酶HisG的活性；还在基因组上增强了大肠杆菌组氨酸操纵子基因hisDBCHAFI的表达，从而增强组氨酸的终端合成途径；还在基因组上整合了来源于谷氨酸棒杆菌的精氨酸/赖氨酸转运蛋白的编码基因lysE并使其强表达，以促进胞内组氨酸的向胞外分泌；还在基因组上整合了枯草芽孢杆菌的谷氨酸脱氢酶编码基因rocG并使其强表达，以促进组氨酸的生成。进一步地，所述大肠杆菌为E.coliW3110。进一步地，所述组氨酸操纵子基因hisDBCHAFI，包含hisD、hisB、hisC、hisH、hisA、hisF和hisI七个基因，增加了所述七个基因在大肠杆菌基因组上的拷贝数。进一步地，所述谷氨酸棒杆菌ATP转磷酸核糖基酶HisG突变体编码基因hisG*整合在大肠杆菌基因组上至少两个基因位点处。进一步地，可以通过构建强启动子实现外源基因的强表达。作为本专利技术一种较佳实施方式，所述谷氨酸棒杆菌ATP转磷酸核糖基酶HisG突变体编码基因hisG*分别整合在大肠杆菌基因组tdcD和ylbE基因位点，并由启动子Ptrc启动。作为本专利技术一种较佳实施方式，所述谷氨酸脱氢酶编码基因rocG整合到大肠杆菌基因组上的yjhE基因位点，并由启动子Ptrc控制其转录表达。作为本专利技术一种较佳实施方式，所述基因工程菌E.coliWHY3-1是采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术对E.coliW3110进行定向改造所得，具体包括如下步骤：(1)构建启动子Ptrc与核苷酸序列如SEQIDNO:1所示的基因hisG*的连接片段Ptrc-hisG*，并将其分别整合在基因组上tdcD和ylbE基因位点；(2)构建启动子Ptrc与大肠杆菌组氨酸操纵子基因的连接片段Ptrc-hisD-hisC-hisB-hisH-hisA-hisF-hisI，并用分段整合的方法将其整合在基因组上yghX基因位点；(3)构建启动子Ptrc与来源于谷氨酸棒杆菌的lysE基因的连接片段Ptrc-lysE，并将其整合在基因组上yjiT基因位点；(4)构建启动子Ptrc与来源于枯草芽孢杆菌的谷氨酸脱氢酶编码基因rocG连接片段Ptrc-rocG，并将其整合在基因组上的yjhE基因位点。本专利技术还提供了一种制备L-组氨酸的方法，所述方法是在适宜条件下培养所述基因工程菌E.coliWHY3-1，并从其培养物中收集组氨酸。有益效果：目前提高组氨酸产量的方法都集中在解除组氨酸合成途径所受的反馈抑制；增强组氨酸的合成途径；增加前体物的供应；阻断组氨酸的代谢途径；以及促进组氨酸向胞外分泌等方面。本专利技术首次通过在组氨酸产生菌中引入枯草芽孢杆菌的谷氨酸脱氢酶，枯草芽孢杆菌的谷氨酸脱氢酶以NADH为辅酶，催化α-酮戊二酸生成谷氨酸的反应，可同时介导谷氨酸和NAD+的再生，而谷氨酸和NAD+分别是组氨酸合成过程中的氨供体和辅酶，从而进一步提高了组氨酸的生产效率。WHY3-1用于发酵法生产组氨酸，利用5L发酵罐发酵36-48小时，可产组氨酸50-65g/L，平均生产强度1.5-2.0g/L/h，最高值达到2.5g/L/h，转化率为0.2-0.24g组氨酸/g葡萄糖。附图说明图1：(a)pREDCas9质粒图谱，(b)pGRB质粒图谱。图2：在tdcD基因位点整合hisG*时整合片段构建及验证电泳图。其中：M：1kbDNAmarker；1：上游同源臂；3：hisG*基因片段；3：下游同源臂；4：重叠片段；5：原菌对照；6：阳性菌的鉴定片段。图3：在ylbE基因位点整合hisG*时整合片段构建及验证电泳图。其中：M：1kbDNAmarker；1：上游同源臂；3：hisG*基因片段；3：下游同源臂；4：重叠片段；5：原菌对照；6：阳性菌的鉴定片段。图4：hisD整合片段构建及验证电泳图。其中：M：1kbDNAmarker；1：上游同源臂；3：hisD基因片段；3：下游同源臂；4：重叠片段；5：原菌对照；6：阳性菌的鉴定片段。图5：hisC-hisB整合片段构建及验证电泳图。其中：M：1kbDNAmarker；1：hisC上游序列-hisC-hisB片段；2：下游同源臂；3：重叠片段；4：原菌对照；5：阳性菌的鉴定片段。图6：hisH-hisA-hisF-hisI整合片段构建及验证电泳图。其中：M：1kbDNAmarker；1：hisH上游序列-hisH-hisA-hisF-hisI片段；2：下游同源臂；3：重叠片段；4：原菌对照；5：阳性菌的鉴定片段。图7：Ptrc-lysE整合片段的构建及验证电泳图。其中：M：1kbDN本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生产L-组氨酸的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是在大肠杆菌的基因组上整合了核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的谷氨酸棒杆菌ATP转磷酸核糖基酶HisG突变体编码基因hisG*并使其强表达；还在基因组上增强了大肠杆菌组氨酸操纵子基因hisD、hisB、hisC、hisH、hisA、hisF和hisI的表达；还在基因组上整合了来源于谷氨酸棒杆菌的精氨酸/赖氨酸转运蛋白的编码基因lysE并使其强表达；还在基因组上整合了枯草芽孢杆菌的谷氨酸脱氢酶编码基因rocG并使其强表达。/n

【技术特征摘要】
1.一种生产L-组氨酸的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是在大肠杆菌的基因组上整合了核苷酸序列如SEQIDNO:1所示的谷氨酸棒杆菌ATP转磷酸核糖基酶HisG突变体编码基因hisG*并使其强表达；还在基因组上增强了大肠杆菌组氨酸操纵子基因hisD、hisB、hisC、hisH、hisA、hisF和hisI的表达；还在基因组上整合了来源于谷氨酸棒杆菌的精氨酸/赖氨酸转运蛋白的编码基因lysE并使其强表达；还在基因组上整合了枯草芽孢杆菌的谷氨酸脱氢酶编码基因rocG并使其强表达。


2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌为E.coliW3110。


3.如权利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，所述谷氨酸棒杆菌ATP转磷酸核糖基酶HisG突变体编码基因hisG*整合在基因组上至少两个基因位点处，并由强启动子启动。


4.如权利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，所述谷氨酸棒杆菌ATP转磷酸核糖基酶HisG突变体编码基因hisG*分别整合在基因组上tdcD和ylbE基因位点，并由启动子Ptrc启动；所述大肠杆菌组氨酸操纵子基因hisD、hisB、hisC、hisH、hisA、hisF和hisI按顺序依次整合在基因组上yghX基因位点，并由启动子Ptrc启动；所述精氨酸/赖氨酸转运蛋白的编码基因lysE整合在基因组上yjiT基因位点，并由启动子Ptrc启动；所述谷氨酸脱氢酶编码基因rocG整合到大肠杆菌基因组上的yjhE基因位点，并由启动子Ptrc启动。


5.权利要求1-4任一项所述基因工程菌用于发酵生产L-组氨酸的用途。


6.一种产L-组氨酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述基因工程菌是采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术对E.coliW3110进行定向改造所得，包括如下步骤：
(1)构建启动子Ptrc与核苷酸序列如SEQIDNO:1所示的基因hisG*的连接片段Ptrc-hisG*，并将其分别整合在基因组上tdcD和ylbE基因位点；
(2)构建启动子Ptrc与大肠杆菌组氨酸操纵子基因的...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢希贤，樊伟明，吴鹤云，蒋卫，田道光，陈燕娜，张悦，屠建情，
申请(专利权)人：浙江震元制药有限公司，天津科技大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33