一种动态调控磷酸葡糖异构酶产组氨酸的基因工程菌株及其构建方法与应用技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，涉及工业微生物的育种，特别涉及一种动态调控磷酸葡糖异构酶生产组氨酸的基因工程菌株及其构建方法与应用。本发明专利技术提供了一种大肠杆菌基因工程菌株，该基因工程菌株以大肠杆菌色氨酸操纵子的启动子P

【技术实现步骤摘要】
一种动态调控磷酸葡糖异构酶产组氨酸的基因工程菌株及其构建方法与应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，涉及工业微生物的育种，特别涉及一种动态调控磷酸葡糖异构酶生产组氨酸的基因工程菌株及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]大肠杆菌中的磷酸葡糖异构酶，由pgi基因编码，催化糖酵解途径第二步反应，是调控糖酵解途径与磷酸戊糖途径代谢流量分配的关键节点。磷酸戊糖途径为胞内各种反应过程提供还原力NADPH，参与脂肪酸和固醇类物质以及一些重要氨基酸如苏氨酸、缬氨酸、精氨酸等的合成。另外，该途径的中间产物，如5
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磷酸
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核糖、4
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磷酸
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赤藓糖等还可以为芳香族氨基酸、核苷等众多胞内重要物质的合成提供原料。因此，降低磷酸葡糖异构酶的表达，以增强磷酸戊糖途径的合成通量是非常重要的改造策略。而糖酵解途径是葡萄糖的主要代谢路径，也是细胞重要的供能途径，与细胞生长关系密切，因此糖酵解途径代谢流量过低会严重影响菌体生长，目标产物的合成也会受到限制。因此，合理调控糖酵解途径和磷酸戊糖途径的代谢流量分配，才能保证在菌体适度生长的前提下，促进磷酸戊糖途径相关产物的合成。
[0003]目前，在多种产物微生物细胞工厂的构建过程中，都对磷酸葡糖异构酶的表达进行了调控。一种方法是直接敲除磷酸葡糖异构酶的编码基因pgi。专利技术人在前期构建组氨酸生产菌的过程中曾通过直接敲除磷酸葡糖异构酶的编码基因pgi，增强磷酸戊糖途径的通量，虽然使得组氨酸的产率大幅提升，但是因为pgi基因的敲除大幅降低了糖酵解途径的合成通量，严重妨碍了菌体生长，导致组氨酸的生产强度明显降低(Highly Efficient Production of l
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Histidine from Glucose by Metabolically Engineered Escherichia coli[J].ACS Synthetic Biology,2020,9,7,1813
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1822)。温廷益(CN106459886A，CN110117568A)等构建组氨酸工程菌的过程中为了强化磷酸戊糖途径，增强组氨酸合成前体物PRPP的供应，敲除pgi基因对菌体的生长有明显的抑制效果且L
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组氨酸产量由1.18g/L降低至0.77g/L。单独对磷酸戊糖途径关键酶zwf过表达，产量由1.18g/L升至1.50g/L；敲除pgi基因的同时过表达zwf基因，产量由1.18g/L升至2.40g/L，L
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组氨酸产量相较对照菌株产量提升102％。说明增强中心代谢流流向磷酸戊糖途径，缓解了糖代谢压力，协调了糖酵解途径与磷酸戊糖途径的碳流平衡，产量增加。但由于静态改造无法调节基因表达强度，较低的酶活导致菌体生长受限，导致生产强度大幅下降。另外，还有一些案例是通过敲除pgi基因调控中心代谢碳流分配，提高葡萄糖利用率及NADPH供给，以促进目标产物的合成(CN1270631A，CN110835621A，CN110656073A，CN105441496A)。这些案例中同样存在菌体生长受阻，降低生产强度的问题。
[0004]另外一种方法是利用诱导型启动子调控pgi基因表达，可在一定程度上缓解上述生长问题。牛腾飞等人(CN107760643A)通过利用启动子、glmS核酶突变体、RBS元件进行组合优化pgi的表达,使重组菌株N3531
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G的GlcNAc产量由14.45g/L增加至18.45g/L,细胞干
重达到15.2g/L,副产物乙偶姻的浓度达到18.2g/L,转化率为0.283g N
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乙酰氨基葡萄糖/g葡萄糖；刘龙等人(CN106148260A)利用木糖诱导型启动子调控pgi基因表达，明显提升了乙酰氨基葡萄糖的产量；张杰等人(CN112961792A)通过甘油诱导型启动子调控pgi基因表达，利用甘油和葡萄糖在培养基中的添加时间来控制菌体生长及肌醇的生产，提高了毕赤酵母工程菌株肌醇的生产能力。但是，利用诱导型启动子调控pgi的转录表达同样存在明显的弊端：一是不同诱导型启动子的强度不同，调控的严谨程度也存在差别，因此很难找到合适的启动子；二是诱导型启动子的使用需要把控合适的诱导时机，过早的切换虽然有利于转化率的提升，但易对生长造成较大影响，使菌株无法达到最优产量及产率，而代谢通路的特异性则使得此类方法并不具有普适性；三是诱导物的添加会增加生产成本，并且这种诱导工艺使发酵过程控制变得更为复杂，也容易造成生产的不稳定。
[0005]综上所述，直接敲除pgi基因虽有助于磷酸戊糖途径相关产物产率的提升，但是菌体生长会受到明显的抑制，从而导致产量或者生产强度的大幅下降，不利于工业化应用。而利用诱导型启动子调控pgi基因的表达时，不同启动子的强度不同，转录的严谨程度也有差异，会影响该方法的使用效果，另外诱导物的添加在增加生产成本的同时也使工艺控制的难度增加，同样不利于产业化应用。

技术实现思路

[0006]针对上述问题，本专利技术的目的是通过一种动态调控磷酸葡糖异构酶表达的方法，可以在满足菌体生长的前提下，有效降低糖酵解途径的通量，加强磷酸戊糖途径，该方法应用于组氨酸工程菌中可以显著提高组氨酸的合成效率。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术采取如下的技术方案：
[0008]第一方面，本专利技术提供了一种大肠杆菌基因工程菌株，该基因工程菌株以大肠杆菌色氨酸操纵子的启动子P
trp
调控pgi基因的转录表达，并且可选的引入以酰基高丝氨酸内酯AHL作为信号分子介导的群体感应系统调控trpR基因的转录表达。
[0009]第二方面，本专利技术提供了如上所述的大肠杆菌基因工程菌株的构建方法，包括：在大肠杆菌中，以色氨酸操纵子的启动子P
trp
替换了pgi基因原有启动子；可选的引入AHL合成酶基因esaI和群体感应转录调控因子EsaR的编码基因esaR，并且以启动子P
esaR
‑
P
替换了trpR基因原有启动子。
[0010]第三方面，本专利技术提供了如上所述的大肠杆菌基因工程菌株在高产组氨酸中的用途。
[0011]本专利技术的有益效果如下：
[0012]本专利技术的关键在于用一种自调控的级联反馈系统动态调控磷酸葡糖异构酶的转录表达，与现有技术相比，本专利技术所提供的动态调控大肠杆菌磷酸葡糖异构酶的方法，可以在满足菌体生长所需的前提下，有效降低糖酵解途径通量，增强磷酸戊糖途径通量，将该方法应用于组氨酸工程菌的构建，所得菌株摇瓶发酵24h后，相较于对照菌株，组氨酸的产量由3.1g/L提高至6.5g/L，糖酸转化率由3.9％提升至11.7％，产量、转化率和单位菌体产量分别提升109.7％、200％和242.4％，效果显著。
[0013]本专利技术中磷酸葡糖异构酶的调控是一种自调控方法，无须诱导物的添加。并且通过调整酰基高丝氨酸内酯(AHL)合成酶编码基因esa本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种大肠杆菌基因工程菌株，其特征在于：所述基因工程菌株以大肠杆菌色氨酸操纵子的启动子P
trp
调控pgi基因的转录表达，优选的，该基因工程菌株还引入以酰基高丝氨酸内酯AHL作为信号分子介导的群体感应系统调控trpR基因的转录表达。2.根据权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于：所述基因工程菌株还引入以酰基高丝氨酸内酯AHL作为信号分子介导的群体感应系统调控trpR基因的转录表达，包括：引入AHL合成酶基因esaI和群体感应转录调控因子EsaR的编码基因esaR，并且以启动子P
esaR
‑
P
替换了trpR基因原有启动子。3.根据权利要求2所述的基因工程菌株，其特征在于：所述启动子P
trp
的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；和/或所述AHL合成酶基因esaI的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；和/或所述基因esaR的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。4.根据权利要求2所述的基因工程菌株，其特征在于：所述AHL合成酶基因esaI连接有启动子P
esaR
‑
P
，所述启动子P
esaR
‑
P
的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；和/或所述基因esaR连接有启动子P
trc
，所述启动子P
trc
的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。5.根据权利要求1
‑
4任一所述的基因工程菌株，其特征在于：所述基因工程菌株的出发菌株为E.coli WHY2
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3，所述E.coli WHY2
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3是以E.coli W3110为出发菌株过表达大肠杆菌组氨酸操纵子基因hisD、hisB、hisC、hisH、hisA、hisF和hisI，以及异源过表达核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的谷氨酸棒杆菌ATP转磷酸核糖基酶HisG突变体编码基因hisG*而获得。6.权利要求1
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5任一所述基因工程菌株的构建方法，其特征在于：所述方法包括：在出发菌株大肠杆菌中，以色氨酸操纵子的启动子P
trp
替换了pgi基因原有启动子；并且可选的引入AHL合成酶基因esaI和群体感应转录调控因子EsaR的编码基因esaR，并且以启动子P
esaR
‑
P
替换了trpR基因原有启动子。7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于：所述构建方法进一步包括：(1)在出发菌株大肠杆菌中，使用基因编辑方法将pgi基因原有启动子P
pgi
替换为色氨酸操纵子的启动子P
trp
，获得菌株HIS RP
‑
3；(2)在菌株HIS RP
‑
3中，使用基因编辑方法将trpR基因原有启动子P
trpR

【专利技术属性】
技术研发人员：谢希贤，李镠，吴鹤云，谢华丽，屠建情，
申请(专利权)人：浙江震元制药有限公司，
类型：发明
国别省市：