一种阿拉伯糖转化丰原素的枯草芽孢杆菌人工菌株构建方法技术

本发明专利技术提供一种利用阿拉伯糖转化丰原素的枯草芽孢杆菌人工菌株构建方法；以Bacillussubtilis 168为研究对象，利用CRISPR

【技术实现步骤摘要】
一种阿拉伯糖转化丰原素的枯草芽孢杆菌人工菌株构建方法


[0001]本专利技术属于枯草芽孢杆菌基因工程
，具体涉及CRISPR
‑
Cas9技术通过启动子替换、脂肪酸前体途径强化改善丰原素合成。选择内源性强启动子P
ylb
替换丰原素天然合成酶基因簇启动子P
pps
，在此基础上对3
‑
羟基辅酶A水合酶基因fadB进行敲除，对长链脂肪酸辅酶A连接酶基因yhfL以及编码生物素羧化酶基因yngH、异源硫酯酶tesA基因进行过表达。所构建菌株以阿拉伯糖为碳源进行发酵，提出一种利用阿拉伯糖转化丰原素枯草芽孢杆菌人工菌株的构建方法。

技术介绍

[0002]丰原素(fengycin)，又名芬芥素、芬荠素，是由芽孢杆菌产生的低分子量两亲性环脂肽家族成员之一，由一个C14
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C18的β羟基脂肪酸链和氨基酸(L
‑
Glu
‑
D
‑
Orn
‑
D
‑
Tyr
‑
D
‑
allo
‑
Thr
‑
L
‑
Glu
‑
D
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Ala/Val
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L
‑
Pro
‑
L
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Gln
‑
L
‑
Tyr
‑
L
‑
Ile)组成的环肽，包括丰原素A、B、C、S和plipastatin等多种变体。具有抗菌、抗肿瘤、抗生物黏附、抗凝聚等多种生物活性，作为生物防治剂、抗肿瘤药物、纳米药物载体、材料涂层、乳化剂等应用潜力极大。
[0003]目前对丰原素合成的底盘细胞的研究主要集中在B.amyloliquefaciens fmbJ
‑
60、B.velezensis FZB42、Bacillus subtilis ATCC21332、Bacillus subtilis F29
‑
3以及Bacillus subtilis 168等。Bacillus subtilis 168作为一种GRAS模式微生物底盘，安全性良好，工业上作为生产菌株安全性可以得到保障；同时不存在密码子的偏好性，胞外蛋白分泌能力强；遗传背景清晰，便于进行菌种改造；拥有较为成熟的发酵技术，具有广阔的工业生产潜力。但是在以往的报道中Bacillus subtilis 168的发酵水平尚处于较低的阶段，且对其研究多体现在丰原素合成酶基因簇的启动子替换，对启动子的选择性与重要前体——脂肪酸的研究较少，因此寻求可替换的启动子、强化脂肪酸代谢流对于丰原素的生产具有重要意义。
[0004]近年来，科研工作者对丰原素的研究主要集中在启动子替换、发酵方式的优化。例如Hussein等以P
repU
替换Bcaillus subtilis 168中丰原素天然启动子，优化体积氧传质系数(kLa)和体积平均功耗(PVL)，丰原素产量达到507mg/L(W.Hussein,S.Fahim.Plipastatin Over
‑
production in Bacillus subtilis using Site Direct Mutation[J].Research Journal of Pharmaceutical Biological and Chemical Sciences,2017,8(3):1013
‑
1020)。Yaseen等将外源高产菌株BBG21的P
fen
启动子替换其内源性启动子，丰原素产量增加了10倍(Y.Yaseen,F.Gancel,M.Bechet,D.Drider,P.Jacques.Study of the correlation between fengycin promoter expression and its production by Bacillus subtilis under different culture conditions and the impact on surfactin production[J].Archives of Microbiology,2017,199(10):1371
‑
1382)。此外还有一些组成型的强启动子、诱导型启动子也逐渐被应用于脂肽的合成中。但这些启动子存在表达强度过高造成菌体负担、诱导剂价格昂贵、发酵中添加易污染等问题，因此，寻找时期特异性启动子以在细胞生长特定时期启动基因的高表达，使得生长与
生产彼此协调在工业化中更有意义。P
ylb
作为芽孢杆菌中新发掘的时期特异性启动子(J.T.Xu,X.Q.Liu,X.X.Yu,X.Y.Chu,J.Tian,N.F.Wu.Identification and characterization of sequence signatures in the Bacillus subtilis promoter P
‑
ylb for tuning promoter strength[J].Biotechnology Letters,2020,42(1):115
‑
124)，其可实现稳定期基因高表达，对稳定期次级代谢物的生产如丰原素等的潜力具大。
[0005]丰原素由亲水的寡肽与疏水的脂肪酸链组成的低分子量环脂肽，其中β
‑
羟基脂肪酸作为其重要前体，由合成酶基因簇C结构域对其进行选择活化，因此脂肪酸的含量在一定程度上决定了丰原素起始合成速率。脂肪酸已被报道影响surfactin的合成，例如过表达生物素羧化酶亚基基因yngH的工程菌株TS1726在摇瓶中surfactin的产量增加到13.37g/L，且相比于一般的乙酰辅酶A羧化酶亚基accBC、AD具有更高催化乙酰辅酶A合成脂肪酸的活性(M.M.Wang,H.M.Yu,Z.Y.Shen.Antisense RNA
‑
Based Strategy for Enhancing Surfactin Production in Bacillus subtilis TS1726 via Overexpression of the Unconventional Biotin Carboxylase II To Enhance ACCase Activity[J].Acs Synthetic Biology,2019,8(2):251
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256)，暗示了yngH可能作为胞内脂肪酸代谢调控的又一靶点。但在之前的研究中脂肪酸影响丰原素合成的报道较少，Tan等(CN113278644
‑
A)通过过表达脂肪酸合成的限速途径丙二酰辅酶A合成途径的相关基因(acs、birA和accACD)，将丰原素产量提升为24.73mg/本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用阿拉伯糖转化丰原素的枯草芽孢杆菌人工菌株构建方法；其特征是，利用CRISPR
‑
Cas9技术将丰原素合成酶基因簇的启动子用P
ylb
进行替换，在此基础上敲除3
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羟基辅酶A水合酶基因fadB、过表达长链脂肪酸辅酶A连接酶基因yhfL以及生物素羧化酶基因yngH、硫酯酶基因tesA，提出一种利用阿拉伯糖合成丰原素的枯草芽孢杆菌人工菌株构建方法。2.如权利要求1所述的方法，其特征是，包括步骤如下：1)利用核苷酸序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3，分别设计Oligo引物对应获得sgP
pps
基因、sgfadB基因、sgamyE基因；2)将1)中的sgP
pps
基因、sgfadB基因、sgamyE基因分别连入pJOE8999载体接构建质粒pJOE8999
‑
sgP
pps
、pJOE8999
‑
sgfadB、pJOE8999
‑
sgamyE；3)利用核苷酸序列SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9，设计PCR引物，以Bacillus subtilis 168基因组为模板，对应扩增敲除靶点上下游同源臂基因sgP
pps
‑
UP、sgP
pps
‑
DOWN，sgfadB
‑
UP、sgfadB
‑
DOWN及sgamyE
‑
UP、sgamyE
‑
DOWN；4)利用核苷酸序列SEQ ID NO:10，设计PCR引物，以Bacillus subtilis 168基因组为模板，获得P
ylb
启动子；5)利用核苷酸序列SEQ ID NO:11，设计PCR引物，以Bacillus subtilis 168基因组为模板，扩增长链脂肪酸辅酶A连接酶基因yhfL；6)利用核苷酸序列SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13，设计PCR引物，以Bacillus subtilis 168基因组为模板，分别扩增P43启动子、生物素羧化酶基因yngH；利用核苷酸序列SEQ ID NO:14，设计PCR引物，以Escherichia coli K
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【专利技术属性】
技术研发人员：闻建平，靳佳琦，银莹，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：