一种阿拉伯糖转化丰原素的枯草芽孢杆菌人工菌株构建方法技术

本发明专利技术提供一种利用阿拉伯糖转化丰原素的枯草芽孢杆菌人工菌株构建方法；以Bacillussubtilis 168为研究对象，利用CRISPR

【技术实现步骤摘要】
一种阿拉伯糖转化丰原素的枯草芽孢杆菌人工菌株构建方法


[0001]本专利技术属于枯草芽孢杆菌基因工程
，具体涉及CRISPR
‑
Cas9技术通过启动子替换、脂肪酸前体途径强化改善丰原素合成。选择内源性强启动子P
ylb
替换丰原素天然合成酶基因簇启动子P
pps
，在此基础上对3
‑
羟基辅酶A水合酶基因fadB进行敲除，对长链脂肪酸辅酶A连接酶基因yhfL以及编码生物素羧化酶基因yngH、异源硫酯酶tesA基因进行过表达。所构建菌株以阿拉伯糖为碳源进行发酵，提出一种利用阿拉伯糖转化丰原素枯草芽孢杆菌人工菌株的构建方法。

技术介绍

[0002]丰原素(fengycin)，又名芬芥素、芬荠素，是由芽孢杆菌产生的低分子量两亲性环脂肽家族成员之一，由一个C14
‑
C18的β羟基脂肪酸链和氨基酸(L
‑
Glu
‑
D
‑
Orn
‑
D
‑
Tyr
‑r/>D
‑本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用阿拉伯糖转化丰原素的枯草芽孢杆菌人工菌株构建方法；其特征是，利用CRISPR
‑
Cas9技术将丰原素合成酶基因簇的启动子用P
ylb
进行替换，在此基础上敲除3
‑
羟基辅酶A水合酶基因fadB、过表达长链脂肪酸辅酶A连接酶基因yhfL以及生物素羧化酶基因yngH、硫酯酶基因tesA，提出一种利用阿拉伯糖合成丰原素的枯草芽孢杆菌人工菌株构建方法。2.如权利要求1所述的方法，其特征是，包括步骤如下：1)利用核苷酸序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3，分别设计Oligo引物对应获得sgP
pps
基因、sgfadB基因、sgamyE基因；2)将1)中的sgP
pps
基因、sgfadB基因、sgamyE基因分别连入pJOE8999载体接构建质粒pJOE8999
‑
sgP
pps
、pJOE8999
‑
sgfadB、pJOE8999
‑
sgamyE；3)利用核苷酸序列SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9，设计PCR引物，以Bacillus subtilis 168基因组为模板，对应扩增敲除靶点上下游同源臂基因sgP
pps
‑
UP、sgP
pps
‑
DOWN，sgfadB
‑
UP、sgfadB
‑
DOWN及sgamyE
‑
UP、sgamyE
‑
DOWN；4)利用核苷酸序列SEQ ID NO:10，设计PCR引物，以Bacillus subtilis 168基因组为模板，获得P
ylb
启动子；5)利用核苷酸序列SEQ ID NO:11，设计PCR引物，以Bacillus subtilis 168基因组为模板，扩增长链脂肪酸辅酶A连接酶基因yhfL；6)利用核苷酸序列SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13，设计PCR引物，以Bacillus subtilis 168基因组为模板，分别扩增P43启动子、生物素羧化酶基因yngH；利用核苷酸序列SEQ ID NO:14，设计PCR引物，以Escherichia coli K
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【专利技术属性】
技术研发人员：闻建平，靳佳琦，银莹，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：