一种用于生产甘精胰岛素的培养基制造技术

本发明专利技术属于发酵工程领域，具体涉及一种用于生产甘精胰岛素的培养基，公开了其培养基配方及发酵过程各控制参数，其基础培养基包含酵母提取物8～15g/L，酵母蛋白胨15～20g/L，甘油10～30g/L，柠檬酸1～5g/L，磷酸氢二胺2～10g/L，磷酸二氢钾5～20g/L，硫酸镁0.2～2g/L，氯化钠0.2～2g/L，微量元素0.4～0.6ml/L。本发明专利技术通过优化基础培养基与补料培养基组成、控制发酵条件，分段控制发酵诱导前后的pH值，获得高产甘精胰岛素的同时将质粒丢失率控制在4％以内，电泳表达量在45％以上。本发明专利技术的甘精胰岛素高密度发酵提高了生产效率，具有很好的应用前景。前景。

【技术实现步骤摘要】
一种用于生产甘精胰岛素的培养基


[0001]本专利技术属于发酵工程领域，具体涉及一种用于生产甘精胰岛素的培养基。

技术介绍

[0002]发酵研究的主要目标在于使用高生产率技术使目的产品产生良好的成本效益。由于大多数蛋白在重组大肠杆菌中属于细胞内累积，故生产率与终细胞密度及单位生产率成正比关系。高密度发酵不仅可以提高生产率，还能降低培养容积、生产成本及设备投资，同时便于下游加工、减少废水排放，故高密度培养成为近年来发酵工业重要目标与方向之一。稳定的pH值是使菌体保持最佳生长状态的必要条件，由于外界的pH值变化会通过弱酸或弱碱的变化而改变菌体细胞内的pH值，从而影响细菌的代谢反应，因此发酵过程中pH值的改变会影响细胞的生物量和基因产物的表达。另一方面，微生物的生长可引起培养液pH值的变化。在基本培养基中培养微生物，通常pH值会发生较大的变化。铵盐中氨的消耗，或者微生物利用碳源产生的代谢产物即有机酸的积累，都会造成pH值的下降，而有机酸的消耗，以及硝酸盐为氮源时硝酸根的消耗，则造成pH值上升。菌体在生长过程中最适pH值对细菌在生产期包涵体的形成产生很大的影响，如果pH处于菌体生长的最佳状态，菌体自体蛋白的合成增强，干扰重组蛋白合成，产生错误折叠，大量与重组蛋白结构相似的菌体杂蛋白卷入包涵体，使包涵体中重组蛋白相对比率降低，给进一步的纯化工作带来难度。吴军，于公义(微生物学报36(6):433一437,1996)等研究显示，适当提高培养基的pH能减少乙酸盐的抑制作用。基因工程发酵诱导前后的目的不同，生长期为菌体密度的富集提高，生产期为目的产物不断累积。本专利技术基于此，采用了两个阶段不同的pH梯度调控法，既有利于菌体密度的提高和目的产物的表达，还减少了发酵过程乙酸等代谢副产物的产生。
[0003]基因工程菌在发酵过程中重组质粒会出现一定的不稳定性，将导致得不到预期的目的基因产物及产量。质粒的不稳定性分为DNA片段发生重组、缺失或插入的结构性不稳定和细胞分裂时质粒未进入子细胞的分离不稳定。质粒的稳定性受到宿主和质粒的基因型、宿主和质粒的相互作用、基因表达程度、培养温度、营养限制和反应器操作方式等多种遗传和环境因素的影响。基因工程发酵通常需要高密度菌体培养，以获得更多的目的产物，然而过高的菌体密度会影响工程菌的质粒稳定性。
[0004]工程菌高密度培养是获得外源基因表达产物的重要手段，但高密度培养的主要障碍之一是代谢副产物乙酸的积累。随着发酵培养密度的提高，乙酸的积累增加，并直接影响菌体的生长和外源蛋白的表达，逐渐成为制约工程菌高密度培养的重要因素。Jensen(Biotech Bioeng，1990；36：1-11)等报道当培养液中乙酸浓度大于6g/L时，乙酸会明显抑制菌体生长；当乙酸浓度大于2.4g/L时，会显著降低比产率。Konstan(Biotech Bioeng，1990；36(1)：750-758)等报道培养液中乙酸浓度大于15g/L时菌体生长就完全停止了。Boon(Biotechnol Letts，1992；14(12):1115-1118)等人利用从大肠杆菌衍生的三株宿主菌与对应的重组菌做乙酸抑制实验，发现重组菌比宿主菌更容易受到乙酸的抑制。
[0005]CN104726524A公开了一种培养基及用该培养基发酵生产甘精胰岛素前体的方法，
通过添加盐类和微量元素来降低有害代谢产物(主要是乙酸)的积累，改善细胞生长，增加菌体得率，虽然产量有所提升，但仍不理想；CN106282274A公开了一种胰岛素前体蛋白的毕赤酵母高密度发酵方法，CN107022591B公开了一种提高胰岛素及其类似物前体表达的毕赤酵母发酵方法，均属于高密度发酵，但需发酵培养130h以上，发酵周期长。
[0006]传染性海绵状脑病(TSE)是人与动物的一种慢性、致死性、神经性疾病，包括羊痒病(Scrapie)、牛海绵状脑病(BSE，又称疯牛病)、人的克雅氏症(CJD)、GSS综合征等。英国的流行病学(Veterinary Record，1987；121(18):419-420)调查表明BSE最有可能是由于牛长期食用含有羊痒病肉骨粉的饲料而引起。动物源培养基具有潜在的TSE/BSE污染，这样在后续合成制备具体药物时，其药物的安全性也有一定的风险，甚至会危害人类的健康，严重的话还会致人于死亡。
[0007]基因工程菌高密度发酵，不仅需要获得高的菌体密度，还得兼顾乙酸的积累、质粒稳定性和高效表达，四者之间相互影响，相辅相成。通过以上专利和文献可以看出，现有技术通常只顾及了其中的一方面或几方面，特别是考察高密度培养过程中质粒稳定性的文献更少。因此基因工程菌仅按传统的发酵工艺进行生产是远远不够的，需要对影响高密度发酵和外源基因表达的因素进行综合分析，进而探索出一套适于外源基因高效表达的高密度发酵工艺。

技术实现思路

[0008]鉴于现有技术存在的诸多缺陷，本专利技术提供一种杜绝TSE/BSE风险的简单可行的既能提高甘精胰岛素产量，又能保证低质粒丢失率的培养基。
[0009]本专利技术采取pH梯度法，分段控制发酵诱导前后的pH值，即生长期控制适宜的pH值为6.5～6.9,加速菌体生长,生产期提高pH值至7.1～7.5，以减少异体蛋白的干扰，从而提高包涵体中目的蛋白的产量。
[0010]本专利技术的第一个目的在于提供一种用于生产甘精胰岛素的基础培养基，所述基础培养基包含甘油、酵母提取物、酵母蛋白胨、柠檬酸、磷酸氢二铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钠和微量元素。
[0011]优选地，所述微量元素包含硫酸亚铁、硫酸钴、氯化铜、氯化钙、氯化锌、硼酸、硫酸锰。
[0012]进一步优选地，每升基础培养基包括下表1所示的组份：
[0013]表1
[0014]组分浓度(g/L)组分浓度(g/L)酵母提取物8～15磷酸二氢钾5～20酵母蛋白胨15～20硫酸镁0.2～2甘油10～30氯化钠0.2～2柠檬酸1～5微量元素0.4～0.6ml/L磷酸氢二胺2～10——
[0015]进一步优选地，所述微量元素包括下表2所示的组份：
[0016]表2
[0017]组分浓度(g/L)组分浓度(g/L)
硫酸亚铁10～20氯化锌0.5～2.5硫酸钴10～20硼酸0.2～1氯化铜0.2～1硫酸锰0.2～1氯化钙5～15——
[0018]在一个优选的实施方案中，所述基础培养基组分见下表。
[0019]表3
[0020][0021][0022]更进一步地，基础培养基中包括如下所示的组分：
[0023]表4
[0024]组分浓度(g/L)组分浓度(mg/L)酵母提取物8～15硫酸亚铁5～10酵母蛋白胨15～20硫酸钴5～10甘油10～30氯化铜0.1～0.5柠檬酸2氯化钙2.5～7.5磷酸氢二胺4氯化锌0.5～1.0磷酸二氢钾12硼酸0.1～0.4硫酸镁1.2硫酸锰0.1～0.5氯化钠1——
[0025]用酸性或者碱性溶液调节基础培养基pH值。
[0026]在一本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于生产甘精胰岛素的基础培养基，其特征在于，所述培养基包含甘油、酵母提取物、酵母蛋白胨、柠檬酸、磷酸氢二铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钠和微量元素。2.根据权利要求1所述基础培养基，其特征在于，所述微量元素包含硫酸亚铁、硫酸钴、氯化铜、氯化钙、氯化锌、硼酸、硫酸锰。3.根据权利要求1所述基础培养基，其特征在于，所述基础培养基组成为：4.根据权利要求1所述基础培养基，其特征在于，所述微量元素组成为：5.根据权利要求1所述基础培养基，其特征在于，所述基础培养基pH值为6.5～6.9，优选地，基础培养基...

【专利技术属性】
技术研发人员：冀成法，柳常青，刘忠，
申请(专利权)人：鲁南制药集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：