一种完全降解硝基苯的大肠杆菌工程菌的构建方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种完全降解硝基苯的大肠杆菌工程菌的构建方法及其应用，涉及基因工程领域，构建方法包括如下步骤：将来源于恶臭假单胞菌属的十个基因nbzA,nbzB,nbzCa,nbzcb,nbzD,nbzE,nbzF,nbzG,nbzH,和nbzI按照大肠杆菌的密码子偏好性进行结构优化，获得nbzAS,nbzBS,nbzCaS,nbzCbS,nbzDS,nbzES,nbzFS,nbzGS,nbzHS,和nbzIS基因；选择T7启动子和终止子控制所述优化后的十个个基因的表达，完成优化后的十个基因原核表达单元的拼接；在两个相容质粒基础上组装硝基苯完全降解的表达单元；将带有硝基苯完全降解的表达单元的双质粒转入带有T7RNAP基因的大肠杆菌，获得含有十个基因原核表达单元的大肠杆菌工程菌株。该工程菌能在8h内将浓度3mM的硝基苯完全降解，该工程菌具备降解有机污染物硝基苯的能力。程菌具备降解有机污染物硝基苯的能力。程菌具备降解有机污染物硝基苯的能力。

【技术实现步骤摘要】
一种完全降解硝基苯的大肠杆菌工程菌的构建方法及其应用


[0001]本专利技术涉及基因工程领域，具体而言，涉及一种完全降解硝基苯的大肠杆菌工程菌的构建方法及其应用。

技术介绍

[0002]硝基苯，是一类硝基芳香族化合物，广泛应用于各种工业，如医药、农药、染料、炸药等行业。然而，随着工业的发展大量硝基苯污染物被排放到环境中。硝基苯对环境的危害包括两个方面：一方面，这些物质会导致癌症、畸形和突变，根据1986年的癌症指南，硝基苯被归类为B2组致癌物质，另一方面，由于苯环结构的对称性和稳定性，不易降解，因此硝基苯会长期存在和积累，严重威胁着人和其他生物的健康。
[0003]目前，国内外对硝基苯类化合物废水的治理方法总体上可以归纳为物理法、化学法、生物法以及三者的混合技术等四类。物理法包括气提法、萃取法，吸附法等，吸附法是最主要的硝基苯物理治理方法。
[0004]物理法是硝基苯废水处理中最常用的一种方法，具有处理快，效果好，通量大的优点，但是成本较高，易造成二次污染，且不能将硝基苯彻底去除。
[0005]化学法主要是利用氧化反应来消除污染物，主要有H2O2氧化法、光催化氧化法、臭氧氧化法、脉冲放电等离子体处理法、超临界水氧化法和超声波氧化法等技术。化学法造成的二次污染较物理法少，但还是存在费用偏高的问题。常用的理化方法相对于生物法来说成本高且易引起二次污染。
[0006]生物法主要是利用微生物的代谢活性处理环境中的有机污染物，通过人工驯化自然界的菌种或者构建基因工程菌降解污染物，最终使污染物矿化。对于可快速降解污染物的菌株的分离、培养和应用是生物修复法的重要环节。由于其费用低、效率高、无二次污染、能够最大程度地降低污染物的浓度而倍受关注，己成为处理有机污染物的理想方法。随着生物强化技术和基因工程技术的广泛应用和发展，利用生物法处理高浓度下难彻底降解的有机物对环境的污染具有广泛应用前景。因此，获得一种能有效降解硝基苯的工程菌，进而实现利用生物修复有机污染物是亟需解决的问题。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种完全降解硝基苯的大肠杆菌工程菌的构建方法及其应用，将来源于恶臭假单胞菌属的的基因片段进行合成优化，利用分子生物学技术，将异源代谢途径导入到大肠杆菌体内，最终获得能有效降解硝基苯的大肠杆菌工程菌，进而达到利用生物修复有机污染物的问题。
[0008]第一方面，本专利技术提供一种完全降解硝基苯的大肠杆菌工程菌的构建方法包括如下步骤：
[0009]将来源于恶臭假单胞菌属的十个基因nbzA,nbzB,nbzCa,nbzcb,nbzD,nbzE,nbzF,nbzG,nbzH,和nbzI按照大肠杆菌的密码子偏好性进行结构优化，获得nbzAS,nbzBS,
nbzCaS,nbzCbS,nbzDS,nbzES,nbzFS,nbzGS,nbzHS,和nbzIS基因；
[0010]选择T7启动子和终止子控制所述优化后的十个个基因的表达，完成优化后的十个基因原核表达单元的拼接；
[0011]在两个相容质粒基础上组装硝基苯完全降解的表达单元；
[0012]将带有硝基苯完全降解的表达单元的双质粒转入带有T7RNAP基因的大肠杆菌，获得含有十个基因原核表达单元的大肠杆菌工程菌株。
[0013]优先的，所述nbzA,nbzB,nbzCa,nbzCb,nbzD,nbzE,nbzF,nbzG,nbzH,和nbzI基因的核苷酸序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10所示。
[0014]第二方面，一种在大肠杆菌中表达的硝基苯降解酶基因组，所述基因组按照大肠杆菌的密码子偏好性进行结构优化，获得nbzAS,nbzBS,nbzCaS,nbzCbS,nbzDS,nbzES,nbzFS,nbzGS,nbzHS,和nbzIS基因，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20所示。
[0015]第三方面，一种在大肠杆菌中表达的硝基苯降解酶基因组，优化后的10个基因分别与T7启动子和终止子融合，分别单独构建基因表达单元；所述T7启动子和终止子序列分别见SEQIDNo.21和SEQIDNo.22所示。
[0016]优选的，选择两个不同复制起点和抗性标记的相容质粒pCamBIA1301和pUC19，将硝基苯完全降解10个基因表达盒组装成两大功能模块。
[0017]优选的，其中nbzCaS,nbzCbS,nbzDS,nbzES,nbzFS,nbzGS基因的表达单元组装到质粒pCamBIA1301上，nbzHS,nbzIS基因的表达单元组装到质粒pUC19上,获得两个多基因表达载体。
[0018]第四方面，一种用于完全降解硝基苯的大肠杆菌工程菌，所述大肠杆菌工程菌是将权利要求6所述的两个多基因大肠杆菌转化载体导入大肠杆菌EG61
‑
BL21
‑
AI，获得的阳性菌株。
[0019]上述完全降解硝基苯的大肠杆菌工程菌在降解硝基苯中应用。
[0020]技术效果：
[0021]本专利技术构建一种含完全降解硝基苯的十个外源基因的大肠杆菌，并能成功表达，实验表明该工程菌能在8h内将浓度3mM的硝基苯完全降解，并进一步采用同位素标记代谢流检测证明通路的完整性，检测结果显示硝基苯最终被完全降解，证明该工程菌具备降解有机污染物硝基苯的能力，在生物修复环境领域具有应用潜力。
附图说明
[0022]为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0023]图1硝基苯降解流程图
[0024]图2阳性菌与对照菌降解效果对比图
[0025]图3不同浓度硝基苯的降解效率图
[0026]图4同位素标记代谢检测结果图。
具体实施方式
[0027]为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0028]以下结合实施例对本专利技术的特征和性能作进一步的详细描述。
[0029]第一方面，本专利技术实施例提供一种完全降解硝基苯的大肠杆菌工程菌的构建方法包括如本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种完全降解硝基苯的大肠杆菌工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：将来源于恶臭假单胞菌属的十个基因nbzA,nbzB,nbzCa,nbzcb,nbzD,nbzE,nbzF,nbzG,nbzH,和nbzI按照大肠杆菌的密码子偏好性进行结构优化，获得nbzAS,nbzBS,nbzCaS,nbzCbS,nbzDS,nbzES,nbzFS,nbzGS,nbzHS,和nbzIS基因；选择T7启动子和终止子控制所述优化后的十个个基因的表达，完成优化后的十个基因原核表达单元的拼接；在两个相容质粒基础上组装硝基苯完全降解的表达单元；将带有硝基苯完全降解的表达单元的双质粒转入带有T7RNAP基因的大肠杆菌，获得含有十个基因原核表达单元的大肠杆菌工程菌株。2.如权利要求1所述完全降解硝基苯的大肠杆菌工程菌的构建方法，其特征在于，所述nbzA,nbzB,nbzCa,nbzCb,nbzD,nbzE,nbzF,nbzG,nbzH,和nbzI基因的核苷酸序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10所示。3.一种在大肠杆菌中表达的硝基苯降解酶基因组，其特征在于，所述基因组按照大肠杆菌的密码子偏好性进行结构优化，获得nbzAS,nbzBS,nbzCaS,nbzCbS,nbzDS,nbzES,nbzFS,nbzGS,nbz...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓永东，姚泉洪，田永生，张文慧，彭日荷，许晶，王波，李振军，高建杰，韩红娟，王丽娟，王宇，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：