一种具有高效合成Wzy型胞外多糖特性的鞘氨醇单胞菌株及其构建方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种具有高效合成Wzy型胞外多糖特性的鞘氨醇单胞菌株及其构建方法和应用，属于功能微生物技术领域。本发明专利技术在鞘氨醇单胞菌菌株NXdP的基础上，将Wzy聚合酶的C端酪氨酸激酶区域(WzyC)的关键活性位点(WalkerA、WalkerA'、WalkerB和C端Tyr簇)进行突变获得既可在好氧又可在微氧条件下合成微生物多糖的鞘氨醇单胞菌株，有利于降低能耗。同时所述鞘氨醇单胞菌菌株生产的微生物多糖在质构特性和构象转变温度方面均有改变，鞘氨醇单胞菌菌株合成的生物多糖比来源于亲本菌株NXdP产生的生物多糖具有更好的弹性、回复性及内聚性，且更具有较低的构象转变温度，可在多行业广泛应用。应用。应用。

【技术实现步骤摘要】
一种具有高效合成Wzy型胞外多糖特性的鞘氨醇单胞菌株及其构建方法和应用


[0001]本专利技术属于功能微生物
，具体涉及一种具有高效合成Wzy型胞外多糖特性的鞘氨醇单胞菌株及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]微生物胞外多糖是由好氧微生物合成的一类由单糖或衍生物经过糖苷键聚合形成的高分子聚合物。微生物多糖种类繁多、性能多样、生产周期短且不受气候和地理环境条件的限制，已经广泛应用于食品、石油、化妆品、地矿、医药、环境保护等二十多个行业几百种用途，是一类与人们生活息息相关的生物技术产品。鞘氨醇单胞菌是一类可合成微生物胞外多糖的菌属，目前已经大量发酵并广泛应用的菌株及其产物鞘氨醇胶主要包括：Sphingomonas elodea ATCC3161及其产物结冷胶，Sphingomonas sp.ATCC31555及其产物韦兰胶，Sphingomonas sp.ATCC53159及其产物迪特胶，Sphingomonas sp.ATCC31961及其产物鼠李胶等。
[0003]充足的氧气是有效生产多糖并获得高产率的前提条件。然而，在多糖发酵过程中，随着发酵液粘度的增加，溶氧量迅速降低，并形成微氧环境，极大的限制了菌株的活性和多糖的生产。以广泛应用的鞘氨醇胶韦兰胶的粘性发酵为例，在发酵20h左右时，氧气的摄入率最高，溶氧量降至最低，粘度开始显著增加。随着搅拌速率的增加，氧气摄入率、溶氧量以及发酵液粘度均有所上升，由此说明氧气的含量直接影响了多糖的产量。而供氧是一个高电能能耗过程。因此，构建在低溶氧条件下可维持菌株活性并持续高效合成胞外多糖的工程菌株是降低能耗、实现资源可持续性发展的有效方案。
[0004]现有技术解决微生物多糖的高耗氧问题主要从发酵工艺和菌株优化两方面进行。一方面，发酵工艺方面，常应用能够增加供氧的叶轮系统和结构合适的反应器，包括搅拌塔反应器、外部循环式反应器、鼓泡柱或气升式反应器等，或者在发酵中后期增加搅拌速率和通气量提高多糖的产量，但是设备能耗显著增加。二方面，在发酵菌株改进方面，将具有携氧能力的透明颤血红蛋白基因vgb转入菌株中，可改变菌株在低溶氧条件的代谢流向，从而有限的增加多糖的产量。因此，这两种工艺的改进并不能从根本上解决菌株合成胞外多糖的高耗氧问题。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种具有高效合成Wzy型胞外多糖特性的鞘氨醇单胞菌株及其构建方法和应用，所述菌株不仅能够在好氧发酵条件下高效生产微生物多糖，而且还能在微氧发酵条件下高效生产微生物多糖。
[0006]本专利技术提供了一种具有高效合成Wzy型胞外多糖特性的鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)菌株，在鞘氨醇单胞菌菌株NXdP的基础上，将Wzy聚合酶的C端酪氨酸激酶区域的关键活性位点进行突变获得；
[0007]所述关键活性位点包括但不限于以下一个或多个区域：Walker A区域、Walker A'区域、Walker B区域和C端Tyr簇。
[0008]优选的，Walker A区域的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；
[0009]Walker A'区域的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；
[0010]Walker B区域的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；
[0011]C端Tyr簇的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
[0012]优选的，Wzy聚合酶的C端酪氨酸激酶区域的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
[0013]Wzy聚合酶的C端酪氨酸激酶区域的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0014]优选的，所述突变包括以下一种或几种：点突变、碱基缺失和插入突变。
[0015]优选的，Walker A区域发生点突变的菌株为T4，保藏编号为CGMCC No.22948。
[0016]本专利技术提供了一种所述具有高效合成Wzy型胞外多糖特性的鞘氨醇单胞菌株的构建方法，包括以下步骤：
[0017]1)提取鞘氨醇单胞菌菌株NXdP的基因组DNA，使用引物对Csu/Cxl对Wzy聚合酶的C端酪氨酸激酶区域进行PCR扩增，得到PCR产物；
[0018]2)将所述PCR产物克隆至质粒中，得到重组载体；
[0019]3)针对Wzy聚合酶的C端酪氨酸激酶区域的关键活性位点设计突变用引物，以所述重组载体为模板，以所述突变用引物进行PCR扩增，得到的突变的重组载体转化原核生物表达系统中，得到的重组菌1；
[0020]4)采用同源重组方法构建Wzy聚合酶的C端酪氨酸激酶区域基因敲除载体；
[0021]5)将所述敲除载体转化原核生物表达系统中，得到的重组菌2和菌株NXdP混合进行接合转移，获得缺失Wzy蛋白C端酪氨酸激酶区域的工程菌株NXdP(ΔwzyC)；
[0022]6)将步骤3)中的重组菌1和缺失Wzy蛋白C端酪氨酸激酶区域的工程菌株NXdP(ΔwzyC)混合进行接合转移，获得鞘氨醇单胞菌株；
[0023]步骤1)～3)和步骤4)～5)之间没有时间顺序的限制。
[0024]优选的，引物Csu的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；
[0025]引物Cxl的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
[0026]本专利技术提供了所述鞘氨醇单胞菌株在发酵生产微生物多糖中的应用。
[0027]优选的，所述发酵包括好氧发酵和微氧发酵；
[0028]所述微氧发酵包括浅盘发酵和/深层静置发酵；
[0029]优选的，所述微生物多糖的质构特性如下：弹性值为0.9～1.1，内聚性值为0.7～0.88，回复性值为0.35～0.67；
[0030]所述微生物多糖的转变温度包括凝胶温度和溶胶温度；
[0031]所述凝胶温度为38～45.0℃；
[0032]所述溶胶温度为34～40℃。
[0033]本专利技术提供的具有高效合成Wzy型胞外多糖特性的鞘氨醇单胞菌菌株，本专利技术在鞘氨醇单胞菌菌株NXdP的基础上，将Wzy聚合酶的C端酪氨酸激酶区域(WzyC)的关键活性位点(Walker A区域、Walker A'区域、Walker B区域和C端Tyr簇)进行突变获得。实验证明，通过缺失全部Wzy聚合酶的C端酪氨酸激酶区域导致菌株NXdP失去产多糖的性能，而将WzyC中关键活性位点进行点突变、序列缺失或插入等突变处理后，得到的菌株能够有效改善鞘氨
醇单胞菌合成Wzy型胞外多糖特性，使其不仅能够在好氧发酵的条件下高效合成微生物多糖，而且还能够使其在微氧发酵条件下实现高效生产微生物多糖的特性，解决了长期以来生产微生物多糖需在好氧条件下发酵的限制问题，有利于降低能耗，更具有广泛的工业应用价值。
[0034]同时，本专利技术提供的鞘氨醇单胞菌菌株，通过基因工程改造Wzy聚合酶的C端酪氨酸激酶区域，使生产的微生物多糖，不仅在微氧发酵条件下产量有极大提高，而且在多糖质构特性和构象转变温度方面有进一步改善，实验表明，鞘氨醇本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种具有高效合成Wzy型胞外多糖特性的鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)菌株，其特征在于，在鞘氨醇单胞菌菌株NXdP的基础上，将Wzy聚合酶的C端酪氨酸激酶区域的关键活性位点进行突变获得；所述关键活性位点包括以下一个或多个区域：WalkerA区域、WalkerA'区域、WalkerB区域和C端Tyr簇。2.根据权利要求1所述具有高效合成Wzy型胞外多糖特性的鞘氨醇单胞菌株，其特征在于，WalkerA区域的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；WalkerA'区域的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；WalkerB区域的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；C端Tyr簇的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。3.根据权利要求1所述具有高效合成Wzy型胞外多糖特性的鞘氨醇单胞菌株，其特征在于，Wzy聚合酶的C端酪氨酸激酶区域的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；Wzy聚合酶的C端酪氨酸激酶区域的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。4.根据权利要求1所述具有高效合成Wzy型胞外多糖特性的鞘氨醇单胞菌株，其特征在于，所述突变包括以下一种或几种：点突变、碱基缺失和插入突变。5.根据权利要求1～4任意一项所述具有高效合成Wzy型胞外多糖特性的鞘氨醇单胞菌株，其特征在于，WalkerA区域发生点突变的菌株为T4，保藏编号为CGMCC No.22948。6.一种权利要求1～5任意一项所述具有高效合成Wzy型胞外多糖特性的鞘氨醇单胞菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)提取鞘氨醇单胞菌菌株NXdP的基因组DNA，使...

【专利技术属性】
技术研发人员：马挺，吴萌萌，李国强，石壮壮，明月，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：