岩藻糖基化低聚糖在芽孢杆菌属中的生产制造技术

本申请公开了用于生产岩藻糖基化低聚糖的非孢子形成的芽孢杆菌属细胞以及用于生产岩藻糖基化低聚糖的方法，其中所述芽孢杆菌属细胞已被遗传工程化以具有乳糖通透酶、GDP

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】岩藻糖基化低聚糖在芽孢杆菌属中的生产
[0001]本专利技术涉及遗传工程的
，特别涉及用于生产岩藻糖基化低聚糖的芽孢杆菌属细胞的遗传工程，并涉及使用所述经遗传工程化的芽孢杆菌属细胞的岩藻糖基化低聚糖的微生物生产。

技术介绍

[0002]人母乳对婴儿具有最佳的营养特性。人母乳中存在的糖类代表人乳的主要成分，排在脂肪和蛋白质之前。除了作为能量来源的乳糖外，人母乳还含有约5至25克/升的复合糖分子，即低聚糖。这些低聚糖仅在人乳中以显著浓度存在，它们统称为人乳低聚糖(HMO)。
[0003]迄今为止已经鉴定出大约200个结构上不同的HMO。所述HMO是基于二糖乳糖(由葡萄糖(Glc)部分和半乳糖(Gal)部分组成)，并具有基于N
‑
乙酰基
‑
葡糖胺(GlcNAc)、岩藻糖(Fuc)、唾液酸(NeuNAc)和半乳糖(Gal)的额外的单糖残基。人乳中HMO的浓度和组成随个体而变化，并且在哺乳期间从初乳中的最多达20g/L至成熟乳汁中的5
‑
10g/L。
[0004]属于所谓“分泌者表型”的妇女的乳含有较高含量的α
‑
1,2
‑
岩藻糖基化HMO。这些妇女表达编码所谓的“岩藻糖基转移酶2”的FUT2基因。在她们的乳中最丰富的HMO是2
’‑
岩藻糖基
‑
乳糖(2
’‑
FL；Fuc(α1
‑
2)Gal(β1
‑
4)Glc)和乳
‑
N/>‑
岩藻戊糖
‑
I(LNPF
‑
I；Fuc(α1
‑
2)Gal(β1
‑
3)GlcNAc(β1
‑
3)Gal(β1
‑
4)Glc)。
[0005]人乳低聚糖在其穿过婴儿肠道时不被消化。由于它们持续存在于婴儿肠道中，它们表现出有益的效果。更具体地说，HMO已被证明是益生元，因为它们是双歧杆菌属(Bifidobacterium)、拟杆菌属(Bacteroides)和乳杆菌属(Lactobacillus)的共生微生物的碳源。因此，HMO支持这些微生物在婴儿肠道中的增殖。
[0006]人乳低聚糖还直接减少了病原体在婴儿肠道中的定殖，因为它们阻止了所述病原体粘附在肠粘膜表面的聚糖结构上。HMO由于其与上皮表面聚糖的结构相似性而发挥诱饵的功能并抑制病原体的入侵，从而降低感染的风险。
[0007]α
‑
1,2
‑
岩藻糖基化HMO已被证明具有针对空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)(最常见的细菌性腹泻的病原体)感染的保护作用。α
‑
1,2
‑
岩藻糖基化HMO还与针对大肠杆菌(Escherichia coli)耐热毒素引起的腹泻的保护作用有关。此外，母乳中较高含量的α
‑
1,2
‑
岩藻糖基化HMO降低了介导腹泻的嵌杯样病毒(calicivirus)的感染风险。HMO，尤其是岩藻糖基化HMO乳
‑
N
‑
岩藻戊糖V(LNFP
‑
V；Gal(β1
‑
3)GlcNAc(β1
‑
3)Gal(β1
‑
4)[Fucα1
‑
3]Glc)，结合艰难梭菌(Clostridium difficile)(医院腹泻最常见病因)毒素A的碳水化合物结合位点。因此，HMO似乎阻止了艰难梭菌毒素A与细胞受体的相互作用。
[0008]此外，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)对上皮细胞的粘附受到2
’‑
FL和3
‑
岩藻糖基乳糖(3
‑
FL；Gal(β1
‑
4)[Fucα1
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3]Glc)的显著抑制。α
‑
1,2
‑
岩藻糖基化HMO和α
‑
1,3
‑
岩藻糖基化HMO阻止了诺如病毒(诺瓦克样病毒，NLV)(急性胃肠炎主要病因)与组织血型抗原的结合。这表明这些HMO抑制诺如病毒衣壳结合宿主受体聚糖的潜力。
[0009]由于HMO的已知益处，特别是岩藻糖基化HMO的已知益处，人们需要有一种具有经济价值的HMO合成方法，以使得这些低聚糖或这些低聚糖中的至少一些可用作婴儿配方物
的补充剂。
[0010]由于供应有限且难以获得单个人乳低聚糖的纯级分，开发了合成这些复杂分子中的一些的化学途径。然而，化学合成和生物催化方法都没有被证明是商业上可持续的。此外，特别是人乳低聚糖的化学合成涉及几种有害化学品的使用，这带来了污染最终产品的风险。
[0011]由于人乳低聚糖的化学合成所涉及的挑战，开发了用于生产HMO的发酵方法。如今，已经公开了主要使用经遗传工程化的大肠杆菌菌株进行的几种HMO(例如2
’‑
岩藻糖基乳糖、3
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岩藻糖基乳糖、乳
‑
N
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四糖、乳
‑
N
‑
新四糖、乳
‑
N
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岩藻戊糖I、乳
‑
N
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二岩藻己糖II、3
’‑
唾液酸乳糖和6
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唾液酸乳糖)的微生物生产。
[0012]迄今为止，重组大肠杆菌细胞被用于工业规模的HMO的微生物生产。然而，大肠杆菌属包括致病成员和非致病成员。尽管非致病大肠杆菌菌株被用于HMO的微生物生产，但在许多司法管辖区(jurisdictions)，此类非致病大肠杆菌未被认为可安全用于生产意欲用于人食用的产品。因此，需要在此类司法管辖区内被认为是安全的属的微生物细胞，以用于生产意欲用于人食用的化合物，以获得所述产品在所述司法管辖区内用于其商业化的监管批准。
[0013]通过使用芽孢杆菌属的细菌细胞解决了该问题，所述芽孢杆菌属的细菌细胞被认为可安全用于人食用，并且能够产生岩藻糖基化低聚糖。
[0014]芽孢杆菌属细菌是需氧或兼性厌氧物种的革兰氏阳性、杆状、形成内生孢子的微生物细胞。芽孢杆菌属属于厚壁菌门(Firmicutes)。芽孢杆菌属成员的基因组在其密码子使用上偏向A
‑
T碱基对。芽孢杆菌属种在自然界中几乎无处不在。例如，它们可以存在于土壤中(枯草芽孢杆菌(B.subtilis))，但也可以存在于极端环境中，如高pH(嗜碱芽孢杆菌(B.alcalophilus))、高温(嗜热芽孢杆菌(B.thermophilus))或高盐(耐盐芽孢杆菌(B.halodurans))。
[0015]芽孢杆菌属包括266个已命名的种，其包括自由生活的种和寄生致病的种。两个芽孢杆菌的种被认为具有医学意义：引起炭疽的炭疽芽本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于生产岩藻糖基化低聚糖的非孢子形成芽孢杆菌属细胞，其中所述细胞已被遗传工程化以具有乳糖通透酶、GDP
‑
岩藻糖生物合成途径和岩藻糖基转移酶。2.根据权利要求1所述的芽孢杆菌属细胞，其中所述孢子形成已通过编码Spo0A、σE和σf的基因中的一个或多个的缺失或功能性失活而受损。3.根据权利要求1或2所述的芽孢杆菌属细胞，其中所述乳糖通透酶是大肠杆菌LacY或其功能性变体。4.根据权利要求1至3中任一项所述的芽孢杆菌属细胞，其中所述GDP
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岩藻糖生物合成途径是从头GDP
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岩藻糖生物合成途径和/或补救途径。5.根据权利要求1至4中任一项所述的芽孢杆菌属细胞，其中所述岩藻糖基转移酶是接受乳糖的岩藻糖基转移酶，优选地选自α
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1,2
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岩藻糖基转移酶和α
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1,3
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岩藻糖基转移酶的岩藻糖基转移酶。6.根据权利要求1至5中任一项所述的芽孢杆菌属细胞，其中与相同种的野生型芽孢杆菌属祖细胞相比，所述芽孢杆菌属细胞缺少任何β
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半乳糖苷酶活性或具有降低的β
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【专利技术属性】
技术研发人员：S，
申请(专利权)人：科汉森母乳低聚糖股份有限公司，
类型：发明
国别省市：