用于生产6制造技术

本发明专利技术公开了用于发酵生产6

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于生产6
’‑
唾液酸乳糖的唾液酸转移酶


[0001]本专利技术涉及唾液酸转移酶及其在生产唾液酸化的低聚糖中的用途。

技术介绍

[0002]到目前为止，已经鉴定出150多种结构不同的人乳低聚糖(HMO)。虽然HMO只代表少量的总人乳营养物，但在过去几十年中，它们对母乳喂养婴儿的发育的有益的作用变得明显。
[0003]在HMO中，观察到唾液酸化的HMO(SHMO)支持婴儿对肠道致病细菌和病毒的抗性。值得注意的是，最近的研究进一步证明了长链SHMO针对坏死性小肠结肠炎——早产儿中最常见和最致命的疾病之一——的保护作用。此外，SHMO被认为支持婴儿的大脑发育及其认知能力。此外，唾液酸化的低聚糖已被证明能中和各种致病微生物的肠毒素，包括大肠杆菌(Escherichia coli)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)和沙门氏菌属(Salmonella)。此外，还发现唾液酸化的低聚糖干扰幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)在肠道的定殖，从而可预防或抑制胃和十二指肠溃疡。
[0004]在人乳中的唾液酸化的低聚糖中，3
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唾液酸乳糖、6
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唾液酸乳糖、唾液酸乳
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N
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四糖a、唾液酸乳
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N
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四糖b、唾液酸乳
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N
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四糖c和二唾液酸乳
‑
N
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四糖是最常见的成员。
[0005]由于唾液酸化的低聚糖具有复杂的结构，它们的化学或(化学)酶法合成具有挑战性，并涉及许多困难，例如，立体化学的控制、特定键的形成、原料的可用性等。因此，市售的唾液酸化的低聚糖由于其天然来源的数量很少而非常昂贵。
[0006]为了克服SHMO缺乏商业可用性，已尝试对微生物的代谢工程化以产生唾液酸化的低聚糖，因为这种方法似乎是以工业规模生产HMO的最有前途的方法。
[0007]微生物发酵使用(过度)表达至少一种异源糖基转移酶的遗传修饰的微生物。当在培养基中和在允许微生物表达所述异源糖基转移酶的条件下培养此类微生物时，HMO可由所述微生物产生并从培养基或细胞裂解物中回收。
[0008]然而，糖基转移酶(包括唾液酸转移酶)通常使用广谱底物，使得它们(过度)表达以生产所需低聚糖通常导致不期望的副产物。通常，这些副产物也是低聚糖，但不得不从所需低聚糖制剂中除去以用于产品的商业用途。然而，从所需的低聚糖中除去这些副产物可能是困难和复杂的。
[0009]到目前为止，已经鉴定和表征了几种来自细菌菌种的唾液酸转移酶(SiaT)，例如来自奈瑟氏菌属(Neisseria)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、巴氏杆菌属(Pasteurella)、螺旋杆菌属(Helicobacter)和发光杆菌属(Photobacterium)以及来自哺乳动物和病毒。根据蛋白质序列相似性，唾液酸转移酶通常被分为六个糖基转移酶(GT)家族。所有真核和病毒唾液酸转移酶被分组为GT家族29，而细菌SiaT则被分组为GT4、GT38、GT42、GT52或GT80家族中。此外，唾液酸转移酶和多唾液酸转移酶可因它们形成的糖苷键而区分为，例如α
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2,3
‑
、α
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2,6
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和α
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2,8
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唾液酸转移酶。所有这些唾液酸转移酶将唾液酸残基从胞苷5
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单磷酸唾液酸(例如CMP
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NeuNAc)转移到多种受体分子，通常是半乳糖
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(Gal)部分、N
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乙酰半乳糖
胺(GalNAc)部分或N
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乙酰葡糖胺(GalNAc)部分或其他唾液酸(Sia)部分。
[0010]几种细菌α
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2,6
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唾液酸转移酶在过去被很好地表征，并且已经被证明适合于生产6
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唾液酸乳糖(6
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SL)。用于微生物6
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SL生产的最常用的酶源自海洋细菌：发光杆菌属种JT
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ISH
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224的Pst
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6，美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)JT0160的St0160，鳆发光杆菌(Photobacterium leiognathi)JT
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SHIZ
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119的PlsT6和鳆发光杆菌(Photobacterium leiognathi)JT
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SHIZ
‑
145的PlsT6。然而，这些已知的细菌α
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2,6
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唾液酸转移酶也产生二唾液酸乳糖作为不期望的副产物。
[0011]Drouillard等人(Carbohydrate Research 345(2010)1394
–
1399)公开了通过编码海洋细菌发光杆菌属种(Photobacterium sp.)JT
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ISH
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224的唾液酸转移酶基因的工程化的大肠杆菌细胞生产6
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唾液酸乳糖。由于该酶的多功能性(promiscuity)(广泛的受体/供体底物接受性)，在培养期间形成副产物如6,6
’
－二唾液酸乳糖和KDO
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乳糖。仅通过下调唾液酸转移酶基因的表达，可以限制这些碳水化合物副产物的积累。然而，唾液酸转移酶基因表达的下调是不期望的妥协，因为这限制了生产方法的生产率及其工业实用性。
[0012]Mehr和Withers(Glycobiology 26(2016):353
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359)使用美人鱼发光杆菌JT0160的代表性α
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2,6
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唾液酸转移酶St0160和发光杆菌属种JT
‑
ISH
‑
224的Pst
‑
6描述了来自糖基转移酶家族80的细菌唾液酸转移酶的唾液酸酶活性(唾液酸化碳水化合物的脱唾液酸化/水解)和反式唾液酸酶(trans
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sialidase)活性(唾液酸残基从唾液酸化的碳水化合物向受体底物的转移)。考虑到唾液酸转移酶在生产不同唾液酸化产物如6
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唾液酸乳糖的方法中的所需应用，导致产物转化和/或降解的酶活性显然是反生产的。
[0013]现有技术清楚地公开了以工业规模经济地生产唾液酸化的低聚糖如6
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唾液酸乳糖的主要限制。特别地，现有技术没有教导如何以可行的方式防止6
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唾液酸乳糖形成二唾液酸乳糖的生产细菌菌株。
[0014]因此，本专利技术的一个目的是提供一种通过微生物发酵以工业规模生产6
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唾液酸乳糖的改本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于生产6
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唾液酸乳糖的α
‑
2,6
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唾液酸转移酶，其中所述α
‑
2,6
‑
唾液酸转移酶是接受乳糖的α
‑
2,6
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唾液酸转移酶，其包含与SEQ IDNo.1和SEQ ID No.2所示的氨基酸序列之一在至少100个氨基酸段上具有至少25％同一性的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的α
‑
2,6
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唾液酸转移酶，其中所述α
‑
2,6
‑
唾液酸转移酶包含与SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的氨基酸序列之一在至少100、至少150、至少200、至少250或至少300个氨基酸段上具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。3.根据权利要求1所述的α
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2,6
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唾液酸转移酶，其中所述α
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2,6
‑
唾液酸转移酶包含SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。4.一种用于生产6
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唾液酸乳糖的遗传工程化的细胞，其中所述细胞已经被基因遗传工程化以具有接受乳糖的α
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2,6
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唾液酸转移酶，所述α
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2,6
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唾液酸转移酶包含与SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的氨基酸序列之一在至少100个氨基酸段上具有至少25％同一性的氨基酸序列。5.根据权利要求4所述的遗传工程化的细胞，其中所述细胞选自原核细胞和真核细胞，优选选自酵母细胞、细菌细胞、古细菌细胞、藻细胞和真菌细胞。6.根据权利要求4或5所述的遗传工程化的细胞，其中所述α
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2,6
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唾液酸转移酶包含与SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的氨基酸序列之一在至少100、至少150、至少200、至少250或至少300个氨基酸段上具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85...

【专利技术属性】
技术研发人员：S，
申请(专利权)人：科汉森母乳低聚糖股份有限公司，
类型：发明
国别省市：