唾液酸化低聚糖在芽孢杆菌属(Bacillus)细胞中的生产制造技术

本申请公开了用于生产唾液酸化低聚糖的非孢子形成芽孢杆菌属细胞，其中所述芽孢杆菌属细胞已被遗传工程化以具有乳糖通透酶、CMP

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】唾液酸化低聚糖在芽孢杆菌属(Bacillus)细胞中的生产
[0001]本专利技术涉及遗传工程的
，特别涉及用于在所述芽孢杆菌属细胞中生产唾液酸化低聚糖的芽孢杆菌属细胞的遗传工程，涉及使用所述芽孢杆菌属细胞发酵生产唾液酸化低聚糖，并涉及如此生产的唾液酸化低聚糖的用途。

技术介绍

[0002]人乳为幼儿提供健康成长和发育所需的所有营养物。人乳中存在的糖类代表其主要成分，排在脂肪和蛋白质之前。除了作为能量来源的乳糖外，人乳还含有更复杂的糖分子，即低聚糖。迄今为止，已在人乳中鉴定出约200种结构上不同的低聚糖。这些低聚糖仅在人乳中以显著浓度存在，它们统称为人乳低聚糖(HMO)。所述HMO基于二糖乳糖(由葡萄糖(Glc)部分和半乳糖(Gal)部分组成)，并具有基于N
‑
乙酰葡糖胺(GlcNAc)、岩藻糖(Fuc)、唾液酸/N
‑
乙酰神经氨酸(NeuNAc)和/或半乳糖(Gal)的额外的单糖残基。人乳中HMO的浓度和组成在个体之间不同，并且在哺乳期内从初乳中最多达20g/L至成熟乳中为5
‑
10g/L。
[0003]相当多的HMO具有至少一个NeuNAc部分。在这些唾液酸化人乳低聚糖(SHMO)中，3
’‑
唾液酸乳糖、6
’‑
唾液酸乳糖、唾液酸乳
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N
‑
四糖a、唾液酸乳
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N
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四糖b、唾液酸乳
‑
N
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四糖c和二唾液酸乳
‑
N
‑
四糖是人乳中最常见的成员。
[0004]唾液酸(Sia)是带有9个碳骨架的带负电荷的单糖家族。自然界中已经发现了50多种这类α
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酮酸。最丰富的唾液酸似乎是N
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乙酰神经氨酸(NANA、NeuNAc、Neu5Ac)。
[0005]唾液酸以聚糖的末端单糖部分存在，聚糖存在于脊椎动物和高等无脊椎动物细胞表面的糖缀合物(糖蛋白和糖脂)中。唾液酸是致病细菌的脂多糖和荚膜多糖的成分，所述致病细菌包括大肠杆菌(Escherichia coli)K1、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)、多杀性巴氏杆菌(Pateurella multocida)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)和无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)。
[0006]观察到唾液酸化HMO支持婴儿对肠道致病细菌和病毒的抗性。值得注意的是，最近的研究进一步证明了长链SHMO抵御坏死性小肠结肠炎——早产儿中最常见和最致命的疾病之一——的保护作用。此外，唾液酸化低聚糖已被证明能中和各种致病微生物的肠毒素，包括大肠杆菌、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)和沙门氏菌属(Salmonella)。此外，还发现唾液酸化低聚糖干扰幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)在肠道的定植，从而预防或抑制胃和十二指肠溃疡。此外，SHMO被认为支持婴儿的大脑发育及其认知能力。
[0007]由于HMO的已知益处，特别是唾液酸化HMO的益处，人们需要一种经济上有价值的其生产方法，以使这些唾液酸化低聚糖或这些唾液酸化低聚糖中的至少一些可用作婴儿配方物的补充剂。
[0008]除母乳喂养婴儿之外，用于其他目的的人乳的可获得性有限，并且难以从天然来源获得单个人乳低聚糖的纯级分，这导致了用于合成它们的化学途径的开发。然而，无论是化学合成还是生物催化体外方法都未被证明具有商业可持续性。此外，人乳低聚糖的化学
合成涉及几种有害化学品的使用，这些化学品具有污染最终产品的风险。
[0009]作为化学和生物催化体外合成的替代方法，已开发了HMO的发酵生产。迄今为止，重组大肠杆菌细胞被用于工业规模的一些HMO的微生物生产。
[0010]然而，大肠杆菌属包括致病成员以及非致病成员。尽管非致病大肠杆菌菌株被用于HMO的微生物生产，但在许多司法管辖区(jurisdictions)，此类非致病大肠杆菌未被认为可安全用于生产意欲用于人食用的产品。这阻碍了通过当前生物技术方法生产的用于人食用的HMO在所述司法管辖区内的监管批准。因此，生产意欲用于人食用的糖类，例如人乳低聚糖，特别是用于婴儿食用的糖类，需要在此类司法管辖区内被认为是人食用安全的或当用于生产用于人食用的化合物时被认为是安全的属的微生物细胞。使用被认为是安全的生产菌株减少了——至少是声称的——糖类对人类健康风险的可能性方面的担忧，并将有助于在大多数司法管辖区获得监管批准。
[0011]通过使用芽孢杆菌属(Bacillus)的细菌细胞生产唾液酸低聚糖，特别是唾液酸HMO，解决了该问题。芽孢杆菌属的一些物种的细菌细胞已经被认为用于人食用或用于生产用于人食用的化合物/食品是安全的。因此，提供了通常被认为是安全的物种和/或菌株的芽孢杆菌属细胞，用于生产唾液酸化低聚糖，特别是用于生产唾液酸化人乳低聚糖。
[0012]芽孢杆菌属细菌是需氧或兼性厌氧物种的革兰氏阳性、杆状、形成内生孢子的微生物细胞。芽孢杆菌属属于厚壁菌门(Firmicutes)。芽孢杆菌属成员的基因组在其密码子使用上偏向A
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T碱基对。芽孢杆菌属种在自然界中几乎无处不在。例如，它们可以存在于土壤中(枯草芽孢杆菌(B.subtilis))，但也存在于极端环境中，如高pH(嗜碱芽孢杆菌(B.alcalophilus))、高温(嗜热芽孢杆菌(B.thermophilus))或高盐(耐盐芽孢杆菌(B.halodurans))。
[0013]芽孢杆菌属包括266个已命名的种，其包括自由生活的种和寄生致病的种。两个芽孢杆菌的种被认为具有医学意义：引起炭疽的炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)和引起食物中毒的蜡样芽孢杆菌(B.cereus)。第三个种苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)，是一种重要的昆虫病原体，能产生杀死昆虫的毒素。因此，它被用作杀虫剂来防治害虫。
[0014]由于其GRAS(公认安全的)状态，几种芽孢杆菌属种，如解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)和枯草芽孢杆菌，被用于食品和制药工业中使用的多种蛋白质和化合物的生物技术生产。
[0015]解淀粉芽孢杆菌是限制性酶BamHI的来源，还合成天然抗生素蛋白barnase。此外，解淀粉芽孢杆菌产生植物唑菌素(plantazolicin)，一种对炭疽芽孢杆菌具有选择性活性的抗生素。解淀粉芽孢杆菌的α
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淀粉酶常用于淀粉水解。解淀粉样芽孢杆菌也是催化蛋白质分解的枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)的来源。
[0016]解淀粉芽孢杆本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于生产唾液酸化低聚糖的非孢子形成芽孢杆菌属细胞，其中所述芽孢杆菌属细胞已被遗传工程化以具有乳糖通透酶、CMP
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NeuNAc生物合成途径和唾液酸转移酶。2.根据权利要求1所述的芽孢杆菌属细胞，其中所述芽孢杆菌属细胞的孢子形成能力已通过编码Spo0A、σE和σF的基因中的一个或多个的缺失或功能性失活而受损。3.根据权利要求1或2所述的芽孢杆菌属细胞，其中所述乳糖通透酶是大肠杆菌LacY或其功能性变体。4.根据权利要求1至3中任一项所述的芽孢杆菌属细胞，其中所述CMP
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NeuNAc生物合成途径使用GlcN
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1P或GlcNAc
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6P作为中间体。5.根据权利要求1至4中任一项所述的芽孢杆菌属细胞，其中所述CMP
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NeuNAc生物合成途径使用唾液酸补救途径。6.根据权利要求1至5中任一项所述的芽孢杆菌属细胞，其中所述唾液酸转移酶是接受乳糖的唾液酸转移酶，优选选自α
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2，3
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唾液酸转移酶、α
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2，6
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唾液酸转移酶和α
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2，8
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唾液酸转移酶的唾液酸转移酶。7.根据权利要求1至6中任一项所述的芽孢杆菌属细胞，其中与相同物种的野生型前体芽孢杆菌属细胞相比，所述芽孢杆菌属细胞缺少任何β
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半乳糖苷酶活性或具有降低的β
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半乳糖苷酶活性。8.根据权利要求7所述的芽孢杆菌属细胞，其中所述芽孢杆菌属细胞已通过至少一个选自yesZ和ganA的基因的...

【专利技术属性】
技术研发人员：S，
申请(专利权)人：科汉森母乳低聚糖股份有限公司，
类型：发明
国别省市：