用于制备UDP-GlcNAc的酶方法技术

本发明专利技术涉及在单一反应混合物中用固定化的或优选共固定化的酶从低成本底物尿苷一磷酸和N

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于制备UDP
‑
GlcNAc的酶方法
专利

[0001]本专利技术涉及在单一反应混合物中用固定化的或优选共固定化的酶从低成本底物尿苷一磷酸和N
‑
乙酰基
‑
D
‑
葡糖胺产生UDP
‑
N
‑
乙酰基
‑
α
‑
D
‑
葡糖胺(UDP
‑
GlcNAc)的酶催化方法。此外，可以调节所述方法以产生GlcN酰化的分子和生物分子，包括糖，特别是人乳寡糖(HMO)，蛋白质，肽，糖蛋白，特别是抗体，或糖肽，以及生物缀合物，特别是碳水化合物缀合物疫苗和抗体
‑
药物缀合物。
[0002]专利技术背景
[0003]尿苷5
′‑
二磷酸基
‑
N
‑
乙酰基
‑
α
‑
D
‑
葡糖胺(UDP
‑
GlcNAc)是许多生物技术应用和食品技术的关键底物。为了制备碳水化合物疫苗以及在增长中的个人化医药领域(即制备用于药物递送的糖纳米材料)中需要UDP
‑
GlcNAc。此外，为了在体外构造单克隆抗体和其它重组体蛋白质的核心结构，广泛地需要UDP
‑
GlcNAc。在婴儿食品(人乳)中，N
‑
乙酰葡糖胺官能化的寡糖构成人乳寡糖的重要组分，和从而有在合成产生的婴儿乳品中包括GlcN酰化的糖的高需求(Carbohydrate Research 432(2016)62
‑
70)。然而，尽管有对UDP
‑
GlcNAc的高需求(数量级为每年按吨计)，但UDP
‑
GlcNAc的可获得性非常有限，甚至对于研究者也如此。迄今，低内毒素UDP
‑
GlcNAc的价格高于每克1500欧元。由于UDP
‑
GlcNAc的高价格，不仅基础和应用研究活动受到妨碍，而且工业应用也被阻碍。
[0004]合成UDP
‑
GlcNAc的生物工程方法策略能够分为体内和体外方法：按五步方法的UDP
‑
GlcNAc化学合成达到仅15％的收率。在代谢上工程改造微生物以作为其代谢的一部分在细胞内或细胞外产生UDP
‑
GlcNAc。然而，缺点是低收率，高水平的不希望副产物，细胞系设计需要的时间和复杂的放大。考虑到法规方面，特别是对于婴儿食品，转基因生物(GMOs)的应用能够严重延缓审批进程。
[0005]相反地，酶合成已显示较高的收率。例如，Zhao等人(Zhao,G.,Guan,W.,Cai,L.,Wang,P.G.,2010,Enzymatic route to preparative
‑
scale synthesis of UDP
‑
GlcNAc/GalNAc,their analogues and GDP
‑
fucose,Nat.Protoc.5,636)使用了三种酶N
‑
乙酰基己糖胺激酶(NahK)、UDP
‑
N
‑
乙酰葡糖胺二磷酸化酶(GlmU)和无机二磷酸酶(PmPpA)以制备规模产生UDP
‑
GlcNac/UDP
‑
GalNAc及其衍生物，收率10％
‑
65％。Chen等人(Chen,Y.,Thon,V.,Li,Y.,Yu,H.,Ding,L.,Lau,K.,Qu,J.,Hie,L.,Chen,X.,2011,One
‑
pot three
‑
enzym synthesis of UDP
‑
GlcNAc derivatives,Chem.Commun.47,10815
‑
10817)设法用相同的酶获得了81％的收率。Shao等人(Shao,J.,Zhang,J.,Nah
á
lka,J.Wang,P.G.,2002,Biocatalytic synthesis of uridine 5
’
diphosphate N
‑
acetylglucosamine by multiple enzymes co
‑
immobilized on agarose beads,Chem.Commun.2586
‑
2587)使用了五种固定化的酶来产生UDP
‑
GlcNAc，最大收率78％。在他们的研究中，将AGX1(哺乳动物型GlmU)和GlmU一起使用来增加从GlcNAc
‑1‑
磷酸产生UDP
‑
GlcNAc的收率。从ADP再生ATP是通过丙酮酸激酶用磷酸烯醇丙酮酸进行的。那些酶被共固定化在Ni
‑
NTA琼胶糖珠上，用来合成尿苷5
’‑
二磷酸N
‑
乙酰葡糖胺。加载了酶的Ni
‑
NTA琼胶糖珠被反复使用，然而它们在反应期间失去酶活性。在五个20小时反应循环之后仅能实现50％收率的产品。进一步的酶测定
揭示GlcNAc磷酸变位酶是珠上最不稳定的酶，由此是观察到总收率下降的主要原因。在反应中加入纯化的Agm1能部分恢复总体活性和增加UDP
‑
GlcNAc收率至78％。
[0006]Ni
‑
NTA琼胶糖珠对于较大规模合成是不实用的。酶在琼胶糖珠上弱结合并且在对最佳UDP
‑
GlcNAc产生所必需的高离子强度的反应混合物中快速洗除。酶的洗除能够严重妨碍检验过程(特别是对于食品和药物施用)，并且使得必需在各次使用之后将珠再装填。此外，在大量的情况下有毒的镍离子从珠释放至溶液；由此使得它们在合成HMOS中的使用很有可能是不可行的。尽管据称对于Ni
‑
NTA来说洗除较低，通常多至1ppm，但在柱再生和再装填期间大量的毒性Ni被释放入废水。(Gaberc
‑
Porekar et al,Chem.Eng.Technol.2005,28(11)，1306
‑
1314)。用中等强度螯合剂洗脱增强Ni
‑
NTA的洗除(Kokhan et al,Analytical Biochemistry 2019,582,113347)。因此，从固体载体洗除的Ni(II)毒性对于大规模应用是严重问题。由于Ni琼胶糖珠容易洗除毒性Ni(II)，所述珠并非机械稳定的。此外，这些珠并非机械稳定的原因是它们的柔软性，这禁止其在搅拌槽反应器中使用(原因是高剪切速率导致琼胶糖珠降解)或在大规模柱装填中使用(原因是压缩)。
[0007]环氧活化的载体能够与位于酶表面上的全部亲核基团(赖氨酸、组氨酸、半胱氨本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.产生尿苷5
′‑
二磷酸基
‑
N
‑
乙酰基
‑
α
‑
D
‑
葡糖胺的方法，包括下述步骤：A)提供溶液，其包含(i)下式代表的尿苷一磷酸和N
‑
乙酰基
‑
D
‑
葡糖胺(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；和提供包含葡萄糖
‑1‑
磷酸尿苷酰基转移酶、N
‑
乙酰基己糖胺激酶、多磷酸激酶和尿苷一磷酸激酶的一组酶；B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下从尿苷一磷酸和N
‑
乙酰葡糖胺产生尿苷5
′‑
二磷酸基
‑
N
‑
乙酰基
‑
α
‑
D
‑
葡糖胺,其中所述一组酶共价地或吸附性地固定化在可重复使用的、机械稳定的固体载体上。2.根据权利要求1的方法，其中所述一组酶共固定化在固体载体上。3.根据权利要求1或2的方法，其中所述一组酶共价地固定化在可重复使用的、机械稳定的固体载体上。4.根据权利要求1
‑
3中任一项的方法，其中所述固体载体由包含聚合物的珠或树脂构成，所述聚合物具有环氧化物官能团、具有氨基环氧化物官能团、具有乙二胺官能团、具有氨基C2官能团、具有氨基C6官能团、具有阴离子/氨基C6间隔物官能团。5.根据权利要求1
‑
4中任一项的方法，其中所述固体载体是用环氧基团官能化的聚合物。6.根据权利要求1
‑
5中任一项的方法，其中所述固体载体由具有至孔径尺寸的多孔珠构成。7.根据权利要求1
‑
6中任一项的方法，其中所述一组酶还包含焦磷酸酶。8.根据权利要求1
‑
7中任一项的方法，其中所述一组酶从发酵肉汤、粗制细胞裂解液、纯化细胞裂解液或细胞匀化物直接共固定化在固体载体上。9.根据权利要求1
‑
8中任一项的方法，其中所述一组酶还包含一域多磷酸激酶2和/或其中所述一组酶还包含二域多磷酸激酶2。10.根据权利要求1
‑
9中任一项的方法，其中腺苷三磷酸在步骤A)中提供的溶液中的浓度范围是0.001摩尔至0.9摩尔每摩尔N
‑
乙酰基
‑
D
‑
葡糖胺。
11.根据权利要求1
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：R，
申请(专利权)人：马克斯，
类型：发明
国别省市：