针对SARS-CoV-2的治疗性和诊断性VHH抗体及其增强方法技术

本发明专利技术涉及抗体技术、蛋白质工程、医学、药理学、感染生物学、病毒学和医学诊断学领域。更具体地，本公开内容提供了防止SARS

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】针对SARS
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CoV
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2的治疗性和诊断性VHH抗体及其增强方法


[0001]本专利技术涉及抗体技术、蛋白质工程、医学、药理学、感染生物学、病毒学和医学诊断学领域。更具体地说，本公开内容提供了防止SARS
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CoV
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2的细胞进入和SARS
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CoV
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2的感染的VHH抗体、用于通过对称匹配VHH融合体进行同源三聚体病毒刺突蛋白的增强的阻断的策略、该策略的实施、用于产生这种对称匹配融合体的方法以及用于灵敏检测SARS
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CoV2感染的VHH抗体。此外，本公开内容提供了针对不同于SARS
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CoV
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2的对称匹配靶结构的同源三聚体VHH抗体。

技术介绍

[0002]COVID
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19大流行使世界陷入了几乎前所未有的医疗和经济危机
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主要是因为可用的治疗手段不足。COVID
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19是由SARS
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CoV
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2(一种属于冠状病毒科的最近进化的病毒)引起的。该病毒最初会感染上呼吸道，但也可能导致肺炎和更多的全身感染，其中对肺、肾脏和/或循环系统造成损害。迄今为止，大约2.2％的WHO记录的感染导致了致命后果，严重病程的可能性随着个体年龄的增长以及风险因素诸如肥胖、糖尿病和慢性肺病或肾病的增加而增加。
[0003]SARS
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CoV
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>2借助其同源三聚体刺突蛋白进入细胞，该蛋白与宿主的ACE2受体对接，随后介导病毒和宿主细胞膜之间的融合，使病毒基因组RNA进入现在感染的宿主细胞。然后宿主细胞被重新编程以产生病毒蛋白，复制病毒RNA，并将复制的RNA包装到下一代病毒颗粒中，然后这些病毒颗粒从宿主细胞中大量脱落以感染更多细胞。
[0004]适应性免疫系统可以通过T细胞介导的细胞毒性反应消除受感染的细胞和/或通过B细胞产生与病毒表面结合并阻止感染的抗体来控制病毒感染(关于教科书的观点，参见：Murphy和Weaver，2016)。这种感染阻断抗体被称为中和抗体。然而，通常只有一小部分产生的抗病毒抗体也具有中和特性。
[0005]免疫球蛋白G(IgG)不仅是最丰富的一类抗体，而且在长期免疫方面也是最重要的一类。IgG由4条多肽链组成，两条轻链和两条重链。它们包含两个抗原结合位点，每个位点由一条重链和一条轻链形成。这种复合结合位点可以赋予病毒中和活性。此外，IgG包含仅由两条重链形成的Fc片段。Fc片段是一个原型免疫效应结构域，其可以与细胞表面受体(称为Fc受体)以及补体系统的组分相互作用。
[0006]然而，在某些情况下，抗体甚至可能通过一种被称为ADE(抗体依赖性增强的简称)的效应帮助病毒进入，这种效应由Fc受体相互作用介导(Kliks等人，1989；Littaua等人，1990)。类似地，免疫系统可能通过将其自身表现为细胞因子风暴的全身过度反应(Chen等人，2020b；Mehta等人，2020)或不适当的补体激活(Magro等人，2020)使患有COVID
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19的患者的病况恶化。
[0007]有效的免疫反应将首先阻止病毒建立感染，或者在初次感染后将病毒载量降低到非致病水平。然而，未充分控制的SARS
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CoV
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2感染可能导致致命后果。在幸存者中，它通常造成永久性损伤(例如，肺功能障碍)并影响生活质量。非常需要一种有效的抗病毒疗法，理
想情况下是采用独立地靶向病毒感染周期的不同步骤的正交治疗线。
[0008]瑞德西韦迄今为止代表了一种仍在试验中的治疗方法。这种核苷类似物抑制SARS
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CoV
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2RNA聚合酶。截至2020年5月，临床研究得出的结果喜忧参半：从死亡率没有下降到住院时间略有减少(Chen等人，2020a)。
[0009]严重感染患者的另一种治疗选择是使用来自已经从COVD
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19康复的个体的多克隆抗体/血浆进行被动免疫(Duan等人，2020)。这种方法被认为是最后的手段，并通常有几个缺点，例如在中和不充分的情况下发生ADE的风险、来自恢复期个体的血清的有限可用性、血浆样品不可避免的批次间差异、传播其他传染病的风险以及当大量混合特异性的抗体从一个人转移到另一个人时的所有其他潜在不利影响。
[0010]一种更先进的方法是从SARS
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CoV
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2感染或康复患者中分离单克隆抗体(Wang等人，2020)。这些可以深入表征并以重组形式可重复地生产。这解决了对于上述血浆疗法提出的一些问题。然而，单克隆抗体的生产成本非常高，因此很难想象将生产规模扩大到治疗大量患者所需的水平是可行的。此外，也不能排除免疫学副作用，例如加重细胞因子风暴、不适当的补体激活或ADE，这主要是由于人/人源化抗体中存在Fc区。
[0011]病毒诊断是应对地方性、流行性或甚至大流行性病毒感染的另一条重要防线。一旦确定了受感染的个体，就可以将他们与人群中仍然健康的部分隔离开来，从而遏制疾病的传播。此外，正确的诊断对于有针对性的治疗、监测感染过程以及监测治疗的成功至关重要。可以通过三个原则诊断SARS
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CoV
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2感染：(1)通过检测病毒RNA，例如通过RT PCR。这可能非常灵敏并报告急性感染；(2)通过检测患者响应感染而产生的抗病毒抗体。这允许潜在更高的吞吐量，但在感染的早期阶段会产生假阴性结果，无法得出当前病毒载量的结论，并且无法区分过去和正在进行的感染。(3)第三种可能是通过抗病毒抗体检测病毒蛋白。这种检测方法报告了急性感染，但可能灵敏度有限，至少在使用ELISA或横向流动装置进行批量检测时，以及当患者的抗体掩盖了各自的表位时。
[0012]骆驼科动物的不同寻常之处在于它们产生只有重链的抗体，其更简单的抗原结合结构域可以很容易地在细菌或酵母中克隆和重组表达(Arbabi Ghahroudi等人，1997)。此类分离的抗原结合结构域随后被称为纳米抗体或VHH抗体(重链均二聚体抗体的可变结构域)。它们的大小仅为～14kDa，大约是传统IgG分子的十分之一。他们发现了许多有用的应用，例如作为结晶伴侣(Rasmussen等人，2011；Chug等人，2015)，作为亲和色谱中的工具，用于定位细胞中的蛋白质或作为二抗的动物友好替代品(Pleiner等人，2015；Pleiner等人，2018)。

技术实现思路

[0013]本专利技术的第一个方面涉及识别SARS
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CoV
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2刺突蛋白S1结构域、特别是SARS
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CoV
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2S1结构域的受体结合结构域(RBD)的VHH抗体。
[0014]VHH抗体选自包含本文公开的CDR3序列或相关CDR3序列的VHH抗本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种识别SARS
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CoV
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2刺突蛋白S1结构域、特别是SARS
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CoV
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2S1结构域的受体结合结构域(RBD)的VHH抗体，其包含：(a)如SEQ ID NO:20、204、208、4、8、12、16、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72、76、80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、172、176、180、184、188、192、196、200、227、231、235、239、243、247、251、255、259、263、267、271、275、279、283、287或291所示的CDR3序列，(b)与(a)的CDR3序列具有至少80％、至少90％或至少95％同一性的CDR3序列，或(c)VHH抗体，其与(a)的VHH抗体竞争结合SARS
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CoV
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2刺突蛋白S1结构域、特别是SARS
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CoV
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2S1结构域的受体结合结构域(RBD)。2.根据权利要求1所述的VHH抗体，其包含：(a)如SEQ ID NO:18
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20、202
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204、206
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208、2
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4、6
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8、10
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12、14
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16、22
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24、26
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28、30
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32、34
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36、38
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40、42
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44、46
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48、50
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52、54
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56、58
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60、62
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64、66
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68、70
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72、74
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76、78
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80、82
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84、86
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88、90
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92、94
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96、98
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100、102
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104、106
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108、110
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112、114
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116、118
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120、122
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124、126
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128、130
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132、134
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136、138
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140、142
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144、146
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148、150
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152、154
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156、158
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160、162
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164、166
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168、170
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172、174
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176、178
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180、182
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184、186
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188、190
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192、194
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196、198
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200、225
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227、229
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231、233
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235、237
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239、241
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243、245
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247、249
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251、253
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255、257
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259、261
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263、265
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267、269
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271、273
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275、277
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279、281
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283、285
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287或289
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291所示的CDR1、CDR2和CDR3序列的组合，(b)与(a)的CDR1、CDR2和CDR3序列的组合具有至少80％、至少90％或至少95％的同一性的CDR1、CDR2和CDR3序列的组合，或(c)VHH抗体，其与(a)的VHH抗体竞争结合SARS
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CoV
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2刺突蛋白S1结构域、特别是SARS
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CoV
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2S1结构域的受体结合结构域(RBD)。3.根据权利要求1或2所述的VHH抗体，其包含：(a)如SEQ ID NO:17、201、205、1、5、9、13、21、25、29、33、37、41、45、49、53、57、61、65、69、73、77、81、85、89、93、97、101、105、109、113、117、121、125、129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169、173、177、181、185、189、193、197、224、228、232、236、240、244、248、252、256、260、264、268、272、276、280、284或288所示的VHH序列，(b)与(a)的VHH序列具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％同一性的序列，或(c)VHH抗体，其与(a)的VHH抗体竞争结合SARS
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CoV
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2刺突蛋白S1结构域、特别是SARS
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CoV
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2S1结构域的受体结合结构域(RBD)。4.根据权利要求1
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3中任一项所述的VHH抗体，其识别SARS
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CoV
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2S1结构域的受体结合结构域(RBD)。5.根据权利要求1
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4中任一项所述的VHH抗体，其能够中和病毒。6.根据权利要求1
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5任一项所述的VHH抗体，其能够中和SARS
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CoV2突变体，特别是SARS
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CoV
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2逃逸突变体，包括英国突变体(Alpha)、南非突变体(Beta)、巴西突变体(Gamma)、印度突变体(Delta)、加利福尼亚突变体(Epsilon)以及在上述任何一种突变体中包含至少一个氨基酸置换的突变体。7.根据权利要求1
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6中任一项所述的VHH抗体，其能够中和包含刺突蛋白RBD的SARS
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CoV2突变体，所述突变体包括RBD中的选自K417T、K417N、L452R、E484K、N501和T478K的至少一个氨基酸置换。8.根据权利要求5
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7中任一项所述的VHH抗体，其以约500pM或更低、约250pM或更低、约170pM或更低、约100pM或更低或约50pM或更低的浓度中和SARS
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CoV
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2或SARS
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CoV
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2突变体。9.根据权利要求1
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8中任一项所述的VHH抗体，其是稳定的，特别是热稳定的或超热稳定的。10.根据权利要求9所述的VHH抗体，当在非还原条件下和/或还原条件下测量时，其具有至...

【专利技术属性】
技术研发人员：D，
申请(专利权)人：马克斯，
类型：发明
国别省市：