在宿主细胞中生产岩藻糖基乳糖制造技术

本发明专利技术属于合成生物学和代谢工程的技术领域。更具体地说，本发明专利技术属于代谢工程化的宿主细胞发酵的技术领域。本发明专利技术记载了通过用经基因修饰的细胞发酵来生产岩藻糖基乳糖的方法，以及在该方法中使用的经基因修饰的细胞。经基因修饰的细胞包含编码参与岩藻糖基乳糖合成的酶的至少一种核酸序列，更具体地，所述细胞包含编码岩藻糖基转移酶的核酸序列，从而合成岩藻糖基乳糖，并且包含至少一个表达膜蛋白的核酸，更具体地是表达能够进行岩藻糖基乳糖转运的膜蛋白的核酸序列。糖转运的膜蛋白的核酸序列。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】在宿主细胞中生产岩藻糖基乳糖
专利

[0001]本专利技术属于合成生物学和代谢工程的
更具体地，本专利技术属于经代谢工程化的宿主细胞发酵
本专利技术记载了通过用经基因修饰的细胞发酵来生产岩藻糖基乳糖的方法，以及该方法中使用的经基因修饰的细胞。经基因修饰的细胞包含至少一种编码参与岩藻糖基乳糖合成的酶的核酸序列，更具体地，所述细胞包含编码岩藻糖基转移酶的核酸序列从而合成岩藻糖基乳糖，并且包含至少一种表达膜蛋白的核酸，更具体地是表达能够进行岩藻糖基乳糖转运的膜蛋白的核酸序列。
[0002]专利技术背景
[0003]如今，已经对80多种属于人乳寡糖(HMO)家族的化合物进行了结构表征。这些HMO代表了一类具有益生元功能的复杂寡糖。此外，HMO与上皮表位的结构同源性解释了针对细菌病原体的保护特性。在婴儿胃肠道内，HMO选择性地滋养选定细菌菌株的生长，并从而促进母乳喂养婴儿中独特肠道微生物群的发展。
[0004]这些人乳寡糖中的一些需要存在最有可能表现出特定生物活性的特定岩藻糖基化的结构。这些岩藻糖基化的寡糖的生产需要岩藻糖基转移酶的作用。这些岩藻糖基转移酶属于糖基转移酶的酶家族，在脊椎动物、无脊椎动物、植物、真菌、酵母和细菌中广泛表达。它们催化岩藻糖残基从供体(通常是鸟苷二磷酸岩藻糖(GDP
‑
岩藻糖))转移到受体，包括寡糖、(糖)蛋白和(糖)脂。如此岩藻糖基化的受体底物参与多种生物学和病理学过程。
[0005]在岩藻糖基乳糖(FL)的微生物发酵生产中，FL在许多情况下是在工业生产宿主中细胞内生产的。在本领域中确定为在细胞中产生寡糖的真正困难的一个问题是所产生的寡糖的细胞内富集及其提取。认为细胞内富集负责对所需寡糖生产的产物抑制作用。合成可能会变慢，或者所需的寡糖可能达到细胞毒性浓度，导致代谢停滞或甚至细胞裂解。
[0006]本专利技术的一个目的是提供工具和方法，通过这些工具和方法可以以有效率的、时间和成本有效的方式生产岩藻糖基乳糖并且产生大量的所需产物。
[0007]根据本专利技术，通过提供用于生产岩藻糖基乳糖的方法和细胞来实现该目的和其他目的，其中细胞被基因修饰以用于生产岩藻糖基乳糖并且包含至少一种编码参与岩藻糖基乳糖合成的酶的核酸序列，更具体地，所述细胞包含编码岩藻糖基转移酶的核酸序列，从而合成岩藻糖基乳糖。根据本专利技术，所述细胞还表达膜蛋白，更具体地，所述细胞还表达先前未知的膜蛋白以能够进行岩藻糖基乳糖转运。

技术实现思路

[0008]专利技术概述
[0009]令人惊奇的是，现在已经发现本专利技术中使用的膜蛋白提供了新鉴定的膜蛋白，更具体地，本专利技术提供了新鉴定的先前未知的膜蛋白所述膜蛋白能够进行岩藻糖基乳糖转运并对岩藻糖基乳糖的发酵生产具有积极影响，当用于基因改造生产岩藻糖基乳糖的宿主细胞时，提供更好的产量、生产率、比生产率和/或生长速度。
[0010]本专利技术还提供了生产岩藻糖基乳糖的方法。岩藻糖基乳糖是用包含本专利技术的膜蛋
白的宿主细胞获得的。
[0011]定义
[0012]本说明书中用于描述本专利技术及其各种实施方案的词语不仅应理解为它们通常定义的含义，而且应通过在本说明书中的特殊定义包括超出通用定义范围的结构、材料或行为。因此，如果要素在本说明书的上下文中可以被理解为包括不止一个含义，那么它在权利要求中的使用必须被理解为对说明书和该词本身支持的所有可能含义是通用的。
[0013]本文公开的本专利技术的实施方案的各种实施方案和方面不仅以在本说明书中具体描述的顺序和上下文中被理解，而且包括任何顺序及其任何组合。当上下文需要时，所有以单数形式使用的词语均应视为包括复数形式，反之亦然。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语通常具有与本专利技术所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。一般而言，本文所用的命名法以及本文所述的细胞培养、分子遗传学、有机化学和核酸化学以及杂交中的实验室程序是本领域熟知和常用的那些。标准技术用于核酸和肽合成。通常，酶促反应和纯化步骤根据制造商的规格执行。
[0014]在附图和说明书中，已经公开了本专利技术的实施方案，并且尽管使用了特定术语，但是这些术语仅在描述意义上使用，而不是出于限制的目的，本专利技术的范围在以下权利要求中阐述。必须理解，所示出的实施方案仅出于示例的目的而阐述，并且不应将其视为限制本专利技术。对于本领域的技术人员来说，显而易见的是，可以按照本文公开的文字和精神以及在本公开的范围内进行修改、其他实施方案、改进、细节和使用，本公开的范围仅限于根据专利法解释的权利要求，包括等同原则。在随后的权利要求书中，用于指定权利要求步骤的参考字符仅为便于描述而提供，并不意在暗示执行步骤的任何特定顺序。
[0015]根据本专利技术，术语“多核苷酸”通常指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可以是未修饰的RNA或DNA或者修饰的RNA或DNA。“多核苷酸”包括但不限于：单链和双链DNA，是单链和双链区域或者单链、双链和三链区域的混合物的DNA，单链和双链RNA，以及是单链和双链区域混合物的RNA，包含可以是单链或更典型的双链或三链区域或者单链和双链区域的混合物的DNA和RNA的杂交分子。此外，本文所用的“多核苷酸”是指包含RNA或DNA或者RNA和DNA两者的三链区域。这些区域中的链可以来自相同的分子或来自不同的分子。所述区域可包括所有的一种或多种分子，但更通常仅包括一些分子的区域。三螺旋区域的分子之一通常是寡核苷酸。如本文所用，术语“多核苷酸”还包括如上所述的含有一个或多个修饰的碱基的DNA或RNA。因此，具有出于稳定性或其他原因修饰的主链的DNA或RNA是本专利技术所述的“多核苷酸”。此外，包含不常见碱基(例如肌苷)或修饰的碱基(例如三苯甲基化的碱基)的DNA或RNA应理解为被术语“多核苷酸”涵盖。应当理解，已经对DNA和RNA进行了多种修饰，用于本领域技术人员已知的许多有用目的。本文所用的术语“多核苷酸”包括多核苷酸的此类化学、酶促或代谢修饰形式，以及病毒和细胞(包括例如简单和复杂细胞)的特征性DNA和RNA的化学形式。术语“多核苷酸”还包括通常称为寡核苷酸的短多核苷酸。
[0016]“多肽”是指包含通过肽键或修饰的肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。“多肽”是指通常称为肽、寡肽和寡聚体的短链和通常称为蛋白质的较长链。多肽可包含除20个基因编码的氨基酸之外的氨基酸。“多肽”包括通过自然过程如加工和其他翻译后修饰以及通过化学修饰技术进行修饰的那些。这种修饰在基础教科书和更详细的专著以及大量的研究文献中都有很好的描述，并且它们是技术人员众所周知的。相同类型的
修饰可以以相同或不同程度存在于给定多肽的几个位点上。此外，给定的多肽可以包含多种类型的修饰。修饰可以发生在多肽的任何地方，包括肽主链、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。修饰包括例如乙酰化、酰化、ADP
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核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.通过经基因修饰的细胞生产岩藻糖基乳糖的方法，其包括以下步骤：
‑
提供能够生产岩藻糖基乳糖的细胞，所述细胞包含至少一种编码岩藻糖基转移酶的核酸序列，所述岩藻糖基转移酶将岩藻糖残基从鸟苷二磷酸岩藻糖(GDP
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岩藻糖)供体转移到乳糖受体，从而合成岩藻糖基乳糖，
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所述细胞还包含：i)使岩藻糖基乳糖转运得以进行和/或增强的内源膜蛋白的修饰表达和/或ii)使岩藻糖基乳糖转运得以进行和/或增强的异源膜蛋白的表达，其中所述膜蛋白：i)选自膜蛋白的组，所述膜蛋白包含通过搜索GT10和GT11岩藻糖基转移酶家族的基因组邻域发现的任何一个PFAM结构域，所述GT10和GT11岩藻糖基转移酶家族分别具有如2019年7月4日发布的InterPro 75.0所定义的interpro编号IPR001503和IPR002516，其中所述基因组邻域窗口大小为各岩藻糖基转移酶之前的14个基因和之后的14个基因，并且其中所述膜蛋白不属于SET家族，或ii)选自以下的组：包含SEQ ID NO 204、206、208、210、212、214、216、218的膜蛋白，或者包含SEQ ID NO204、206、208、210、212、214、216、218的膜蛋白中任何一个的功能同源物或功能片段，或者与具有SEQ ID NO 204、206、208、210、212、214、216、218的所述膜蛋白中任何一个具有至少80％序列同一性的序列，
‑
在允许产生所需岩藻糖基乳糖的条件下在培养基中培养细胞，
‑
优选地从培养物中分离岩藻糖基乳糖。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述膜蛋白选自以下的组：a)搬运体；b)P
‑
P键水解驱动的转运蛋白；c)β
‑
桶孔蛋白；d)辅助转运蛋白；e)推定的转运蛋白；和f)磷酸转移体驱动的基团易位蛋白。3.通过经基因修饰的细胞生产岩藻糖基乳糖的方法，其包括以下步骤：
‑
提供能够生产岩藻糖基乳糖的细胞，所述细胞包含至少一种编码岩藻糖基转移酶的核酸序列，所述岩藻糖基转移酶将岩藻糖残基从GDP
‑
岩藻糖供体转移到乳糖受体，从而合成岩藻糖基乳糖，
‑
所述细胞还包含：i)使岩藻糖基乳糖转运得以进行和/或增强的内源膜蛋白的修饰表达和/或ii)使岩藻糖基乳糖转运得以进行和/或增强的异源膜蛋白的表达，其中所述膜蛋白选自以下组：a)搬运体，其中所述膜蛋白不属于SET家族；b)P
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P键水解驱动的转运蛋白；c)β
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桶孔蛋白；d)辅助转运蛋白；e)推定的转运蛋白；和f)磷酸转移体驱动的基团易位蛋白，
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在允许产生所需岩藻糖基乳糖的条件下在培养基中培养所述细胞，
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优选地从培养物中分离岩藻糖基乳糖。4.根据权利要求2或3中任一项所述的方法，其中所述搬运体选自2019年6月17日发布
的由TCDB.org所定义的TCDB类别2.A.1.1、2.A.1.12、2.A.1.15、2.A.1.2、2.A.1.3、2.A.1.36、2.A.1.38、2.A.1.46、2.A.1.68、2.A.1.7、2.A.1.81、2.A.123、2.A.2、2.A.21、2.A.58、2.A.6.3、2.A.66和2.A.7.1的组。5.根据权利要求2或3中任一项所述的方法，其中所述P
‑
P键水解驱动的转运蛋白选自2019年6月17日发布的由TCDB.org所定义的TCDB类别3.A.1.1、3.A.1.2、3.A.1.10、3.A.1.11和3.A.1.5的组。6.根据权利要求2或3中任一项所述的方法，其中所述β
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桶孔蛋白选自2019年6月17日发布的由TCDB.org所定义的TCDB类别1.B.3.1和1.B.18。7.根据具体权利要求2或3中任一项所述的方法，其中所述辅助转运蛋白选自2019年6月17日发布的由TCDB.org所定义的TCDB类别8.A.3。8.根据权利要求2或3中任一项所述的方法，其中所述推定的转运蛋白选自2019年6月17日发布的由TCDB.org所定义的TCDB类别9.B.14和9.B.158的组。9.根据权利要求2或3中任一项所述的方法，其中所述磷酸转移体驱动的基团易位蛋白选自2019年6月17日发布的由TCDB.org所定义的TCDB类别4.A.1.1和4.A.4.1的组。10.根据权利要求2或3中任一项的方法，其中所述搬运体选自2017年11月3日发布的由eggnogdb 1.0.2所定义的eggnog家族05BZS、05C0R、05C2C、05CT4、05CXP、05CZQ、05D94、05DXI、05E5M、05E5W、05E8G、05EAM、05EDR、05EGZ、05F9N、05JHE、05PSV、05W2Y、05W3H、05XJ5、070Q9、07CWC、07QF7、07QNK、07RBJ、07RJ1、07T5E、07VQ3、0814C、088QT、08H15、08N8A、08SC4、08Z4Q的组。11.根据权利要求2或3中任一项所述的方法，其中所述P
‑
P键水解驱动的转运蛋白选自2017年11月3日发布的eggnogdb1.0.2所定义的eggnog家族05BZ1、05CJ1、05EY8、05HAC、05DMK、05DFW、05MFV、07FKK、07R5U、07V1T、08IJ9、08JQ7、172T7的组。12.根据权利要求2或3中任一项所述的方法，其中所述β
‑
桶孔蛋白选自2017年11月3日发布的由eggnogdb1.0.2所定义的eggnog家族05DAY、08KDD的组。13.根据权利要求2或3中任一项所述的方法，其中所述辅助转运蛋白选自2017年11月3日发布的由eggnogdb1.0.2所定义的eggnog家族07SYR的组。14.根据权利要求2或3中任一项所述的方法，其中所述推定的转运蛋白选自2017年11月3日发布的由eggnogdb1.0.2所定义的eggnog家族05CRE、05GWF、06N3A的组。15.根据权利要求2或3中任一项所述的方法，其中所述磷酸转移体驱动的基团易位蛋白选自2017年11月3日发布的由eggnogdb1.0.2所定义的eggnog家族05CI1和05VI0的组。16.根据权利要求2或3中任一项所述的方法，其中所述搬运体选自2018年9月发布的由Pfam 32.0所定义的PF00083、PF00474、PF00873、PF00893、PF01895、PF01943、PF02690、PF03083、PF04193、PF05977、PF07690、PF07690、PF13347、PF13440和PF14667的PFAM列表。17.根据权利要求2或3中任一项所述的方法，其中所述P
‑
P键水解驱动的转运蛋白选自2018年9月发布的由Pfam 32.0所定义的PFAM列表PF00005、PF00532、PF00664、PF01061、PF08352、PF14524、PF13407、PF13416和PF17912。18.根据权利要求2或3中任一项所述的方法，其中所述β
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桶孔蛋白选自2018年9月发布的由Pfam 32.0所定义的PFAM列表PF02264、PF02563、PF10531和PF18412。
19.根据权利要求2或3中任一项所述的方法，其中所述辅助转运蛋白选自2018年9月发布的由Pfam 32.0所定义的PFAM列表PF13807和PF02706。20.根据权利要求2或3中任一项所述的方法，其中所述推定的转运蛋白选自2018年9月发布的由Pfam 32.0所定义的PFAM列表PF01578、PF03932、PF05140和PF11045。21.根据权利要求2或3中任一项所述的方法，其中所述磷酸转移体驱动的基团易位蛋白选自2018年9月发布的由Pfam 32.0所定义的PFAM列表PF00367、PF00358、PF02378、PF03829。22.根据权利要求2或3中任一项所述的方法，其中所述搬运体选自2019年7月4日发布的由InterPro 75.0所定义的interpro列表IPR000390、IPR001036、IPR001411、IPR001734、IPR001927、IPR002797、IPR003663、IPR003841、IPR004316、IPR004633、IPR004638、IPR004734、IPR004812、IPR005275、IPR005828、IPR005829、IPR006603、IPR010290、IPR011701、IPR020846、IPR023008、IPR023721，IPR023722、IPR026022、IPR027417、IPR027463、IPR029303、IPR032896、IPR036259、IPR038078、IPR038377、IPR039672。23.根据权利要求2或3中任一项所述的方法，其中所述P
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P键水解驱动的转运蛋白选自2019年7月4日发布的由InterPro 75.0所定义的interpro列表IPR000412、IPR001734、IPR001761、IPR003439、IPR003593、IPR005829、IPR005978、IPR005981、IPR006059、IPR006060、IPR006061、IPR008995、IPR011527、IPR011701、IPR013456、IPR013525、IPR013563、IPR015851、IPR015855、IPR017871，IPR019554、IPR020846、IPR025997、IPR026266、IPR027417、IPR028082、IPR029439、IPR033893、IPR036259、IPR036640、IPR038377、IPR039421和IPR040582。24.根据权利要求2或3中任一项所述的方法，其中所述β
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桶孔蛋白选自2019年7月4日发布的由InterPro 75.0所定义的interpro列表IPR003192、IPR003715、IPR019554、IPR023738、IPR036998和IPR040716。25.根据权利要求2或3中任一项所述的方法，其中所述辅助转运蛋白选自2019年7月4日发布的InterPro 75.0所定义的interpro列表IPR003856、IPR020846、IPR027417、IPR032807和IPR036259。26.根据权利要求2或3中任一项所述的方法，其中所述推定的转运蛋白选自2019年7月4日发布的InterPro 75.0所定义的interpro列表IPR002541、IPR003439、IPR003593、IPR004316、IPR005627、IPR006603、IPR007816、IPR017871、IPR020368、IPR020846、IPR023648、IPR027417、IPR036259和IPR036822。27.根据权利要求2或3中任一项所述的方法，其中所述磷酸转移体驱动的基团易位蛋白选自2019年7月4日发布的InterPro 75.0所定义的interpro列表IPR001127、IPR001996、IPR003352、IPR004716、IPR010974、IPR011055、IPR013013、IPR018113、IPR018454、IPR036665和IPR036878。28.根据权利要求2或3中任一项所述的方法，其中所述搬运体膜蛋白选自：具有SEQ ID NO 02的来自大肠杆菌(Escherichia coli)K12 MG1655的MdfA，具有SEQ ID NO 06的来自大肠杆菌K12 MG1655的IceT，具有SEQ ID NO 40的来自长双歧杆菌婴儿亚种(B.longum subsp.Infantis)(菌株ATCC 15697)的Blon_2331，具有SEQ ID NO 42的来自长双歧杆菌婴儿亚种(菌株ATCC 15697)的Blon_2332，具有SEQ ID NO 58的来自噬几丁质菌属物种
(Chitinophaga sp.)CF118、具有SEQ ID NO 66的来自栖瘤胃普雷沃氏菌(Prevotella ruminicola)(AR32)、具有SEQ ID NO 64的来自棉子糖乳球菌(Lactococcus raffinolactis)(ATCC 43920)或具有SEQ ID NO 62的来自土壤动杆菌(Dyadobacter soli)DSM 25329的wzx样蛋白，或者上述搬运体膜蛋白中任何一种的功能同源物或功能片段，或者与分别具有SEQ ID NO 02、06、40、42、58、66、64或62的所述MdfA、IceT、Blon_2331、Blon_2332膜蛋白或wzx样膜蛋白中的任何一种具有至少80％序列同一性的序列。29.根据权利要求2或3中任一项所述的方法，其中所述P
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P键水解驱动的转运蛋白选自：具有SEQ ID NO 28的来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)菌株SRCM103457的lmrA，具有SEQ ID NO 70或74的来自球形鼠孢菌(Sporomusa sphaeroides)DSM 2875、具有SEQ ID NO 68或72的来自斯巴达黄杆菌(Flavobacterium spartansii)的LpsE膜蛋白，具有SEQ ID NO 76的来自Candidatus Planktophila sulfonica的TolC，具有SEQ ID NO 82的来自Pedobacter ginsengisoli或具有SEQ ID NO 84的来自疣微菌门细菌(Verrucomicrobia bacterium)CG1_02_43_26的MsbA，具有SEQ ID NO 206的来自大肠杆菌K
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12 MG1655的malE，具有SEQ ID NO 208的来自大肠杆菌K
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12 MG1655的malK，具有SEQ ID NO 214的来自大肠杆菌K
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12 MG1655的araF，具有SEQ ID NO 216的来自大肠杆菌K
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12 MG1655的xylF，或具有SEQ ID NO 218的来自大肠杆菌K
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12 MG1655的ytfQ，或者上述P
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P键水解驱动的转运蛋白膜蛋白中任何一种的功能同源物或功能片段，或者与分别具有SEQ ID NO 28、70、74、68、72、76、82、84、206、208、214、216或218的所述lmrA、LpsE、TolC、MsbA、malE、malK、araF、xylF或ytfQ膜蛋白中任何一种具有至少80％序列同一性的序列。30.根据权利要求2或3中任一项所述的方法，其中所述β
‑
桶孔蛋白选自：具有SEQ ID NO 34的来自大肠杆菌K12 MG1655的Wza，或具有SEQ ID NO 204的来自大肠杆菌K12 MG1655的lamB，或者其功能同源物或功能片段，或者与分别具有SEQ ID NO 34或204的所述Wza或lamB膜蛋白具有至少80％序列同一性的序列。31.根据权利要求2或3中任一项所述的方法，其中所述辅助转运蛋白选自：具有SEQ ID NO 88的来自海栖热袍菌(Thermotoga maritima)(菌株ATCC 43589/MSB8/DSM 3109/JCM 10099)的Wzc，或者其功能同源物或功能片段，或者与具有SEQ ID NO 88的所述Wzc膜蛋白具有至少80％序列同一性的序列。32.根据权利要求2或3中任一项所述的方法，其中所述推定的转运蛋白选自：具有SEQ ID NO 90的来自梭菌属物种(Clostridium sp.)CAG:1013的、具有SEQ ID NO 92的来自内脏臭气杆菌(Odoribacter splanchnicus)DSM 20712、具有SEQ ID NO 94的来自松江菌属物种(Mitsuaria sp.)PDC51或具有SEQ ID NO 96的来自中间普雷沃杆菌(Prevotella intermedia)ATCC 25611(DSM 20706)的CutC，或者所述CutC膜蛋白中任何一种的功能同源物或功能片段，或者与分别具有SEQ ID NO 90、92、94或96的所述CutC膜蛋白中任何一种具有至少80％序列同一性的序列。33.根据权利要求2或3中任一项所述的方法，其中所述磷酸转移体驱动的基团易位蛋白选自：具有SEQ ID NO 210的来自大肠杆菌K12 MG1655的nagE，具有SEQ ID NO 212的来自大肠杆菌K12 MG1655的srlB，或者所述nagE或srlB膜蛋白中任何一种的功能同源物或功能片段，或者与分别具有SEQ ID NO 210或212的所述nagE或srlB膜蛋白中任何一种具有至少80％序列同一性的序列。
34.根据权利要求2或3中任一项所述的方法，其中所述搬运体膜蛋白选自：具有SEQ ID NO 02的来自大肠杆菌K12 MG1655的MdfA，具有SEQ ID NO 06的来自大肠杆菌K12 MG1655的IceT，具有SEQ ID NO 04的来自大肠杆菌K12 MG1655的YnfM，具有SEQ ID NO 08的来自大肠杆菌K12 MG1655的Yhhs，具有SEQ ID NO 10的来自大肠杆菌K12 MG1655的EmrD，具有SEQ ID NO 12的来自大肠杆菌K12 MG1655的YdhC，具有SEQ ID NO 14的来自大肠杆菌K12 MG1655的YbdA，具有SEQ ID NO 16的来自大肠杆菌K12MG1655的YdeE，具有SEQ ID NO 18的来自大肠杆菌K12 MG1655的MhpT，具有SEQ ID NO 20的来自大肠杆菌K12 MG1655的YebQ，具有SEQ ID NO 22的来自大肠杆菌K12 MG1655的YjhB，具有SEQ ID NO 24的来自大肠杆菌K12 MG1655的Bcr，具有SEQ ID NO 26的来自大肠杆菌K12 MG1655的FucP，具有SEQ ID NO 32的来自大肠杆菌K12 MG1655的WzxE，具有SEQ ID NO 38的来自大肠杆菌K12 MG1655的EmrE，具有SEQ ID NO 40的来自长双歧杆菌婴儿亚种(菌株ATCC 15697)的Blon_2331，具有SEQ ID NO 42的来自长双歧杆菌婴儿亚种(菌株ATCC 15697)的Blon_2332，具有SEQ ID NO 46的来自长双歧杆菌婴儿亚种(菌株ATCC 15697)的Blon_0247，具有SEQ ID NO 48的来自长双歧杆菌婴儿亚种(菌株ATCC 15697)的Blon_0245，具有SEQ ID NO 50的来自长双歧杆菌婴儿亚种(菌株ATCC 15697)的Blon_0345，具有SEQ ID NO 52的来自粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)OR74A的CDT2，具有SEQ ID NO 54的来自米曲霉(Aspergillus oryzae)RIB40的CDT2，具有SEQ ID NO 58的来自噬几丁质菌属物种CF118的Wzx，具有SEQ ID NO 60的来自真杆菌属物种(Eubacterium sp.)CAG:581的Wzx，具有SEQ ID NO 62的来自土壤动杆菌(DSM 25329)的Wzx，具有SEQ ID NO 64的来自棉子糖乳球菌(ATCC 43920)的Wzx，具有SEQ ID NO 66的来自栖瘤胃普雷沃氏菌(AR32)的Wzx，具有SEQ ID NO 86的来自汉普森短螺旋体(Brachyspira hampsonii)P280/1的NAPO，具有SEQ ID NO 98的来自猪放线杆菌(Actinobaculum suis)(DSM 20639)的NAm，具有SEQ ID NO 100的来自活泼瘤胃球菌(Ruminococcus gnavus)的NAm，具有SEQ ID NO 102的来自短小杆菌属物种(Curtobacterium sp.)314Chir4.1的NAm，具有SEQ ID NO 104的来自Niabella drilacis(DSM25811)的Nap，具有SEQ ID NO 106的来自Saccharicrinis fermentans(DSM 9555)的Nap，具有SEQ ID NO 108的来自弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)MGH152的mdtD，具有SEQ ID NO 110的来自魏氏柠檬酸杆菌(Citrobacter werkmanii)NBRC 105721的mdtD，具有SEQ ID NO 112的来自无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)的mdtD，具有SEQ ID NO 114的来自产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)的mdtD，具有SEQ ID NO 116的来自阿尔伯蒂埃希氏菌(Escherichia albertii)B156的mdtD，具有SEQ ID NO 118的来自肠沙门氏菌萨拉姆亚种(Salmonella enterica subsp.Salamae)的yegB，具有SEQ ID NO 120的来自肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)30684/NJST258_2的mdtD，具有SEQ ID NO 122的来自肺炎克雷伯菌的Tcr_1_D38215，具有SEQ ID NO 124的来自粪假柠檬酸杆菌(Pseudocitrobacter faecalis)的mdtD，具有SEQ ID NO 126的来自雷金斯堡预研菌(Yokenella regensburgei)(ATCC43003)的Cmr，具有SEQ ID NO128的来自莫金斯克洛诺斯氏菌(Cronobacter muytjensii)的MdfA，具有SEQ ID NO 130的来自产酸克雷伯菌的MdfA，具有SEQ ID NO 132的来自克氏柠檬酸杆菌(Citrobacter koseri)的MFS，具有SEQ ID NO 134的来自旱獭埃希氏菌(Escherichia marmotae)的MdfA，具有SEQ ID NO 136的来自弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)的Cmr，具有SEQ ID NO 138的来自肠沙门氏菌萨拉
姆亚种的MdfA，具有SEQ ID NO 140的来自杨氏柠檬酸杆菌(Citrobacter youngae)(ATCC 29220)的Cmr，具有SEQ ID NO 142的来自弗氏柠檬酸杆菌的MdfA，具有SEQ ID NO 144的来自神户肠杆菌(Enterobacter kobei)的MdfA，具有SEQ ID NO 146的来自肠杆菌属物种(Enterobacter sp.)的MdfA，具有SEQ ID NO 148的来自Lelliottia物种WB101的MdfA，具有SEQ ID NO 150的来自路氏肠杆菌(Enterobacter ludwigii)EcWSU1的MdfA，具有SEQ ID NO 152的来自犹他游动放线菌(Actinoplanes utahensis)的类甜蛋白，具有SEQ ID NO 154的来自噬几丁质菌科细菌(Chitinophagaceae bacterium)PMG_246的类甜蛋白，具有SEQ ID NO 156的来自根瘤菌属物种(Rhizobium sp.)PDC82的类甜蛋白，具有SEQ ID NO 158的来自根际动球菌(Kineococcus rhizosphaerae)(DSM 19711)的类甜蛋白，具有SEQ ID NO 160的来自摩氏摩根氏菌(Morganella morganii)IS15的类甜蛋白，具有SEQ ID NO 162的来自昏暗地嗜皮菌(Geodermatophilus obscurus)(菌株ATCC 25078)的类甜蛋白，具有SEQ ID NO 164的来自慢生根瘤菌属物种(Bradyrhizobium sp.)BTAi1的类甜蛋白，具有SEQ ID NO 166的来自日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)USDA 110的类甜蛋白，具有SEQ ID NO 168的来自野油菜黄单胞菌辣椒斑点病菌株(Xanthomonas campestris pv.vesicatoria str.)85
‑
10的类甜蛋白，具有SEQ ID NO 170的来自水草螺菌(Herbaspirillum aquaticum)的类甜蛋白，具有SEQ ID NO 172的来自黄杆菌属细菌(Flavobacteria bacterium)MS024
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2A的类甜蛋白，具有SEQ ID NO 182的来自草木樨中华根瘤菌(Sinorhizobium medicae)WSM419的rnd样蛋白，具有SEQ ID NO 184的来自巴西固氮螺菌(Azospirillum brasiliense)LMG 04375的阿拉伯糖外流蛋白，或者上述搬运体膜蛋白中任何一种的功能同源物或功能片段，或者具有与分别具有SEQ ID NO 02、06、04、08、10、12、14、16、18、20、22、24、26、32、38、40、42、46、48、50、52、54、58、60、62、64、66、86、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、182或184的所述MdfA、IceT、YnfM、Yhhs、EmrD、YdhC、YbdA、YdeE、MhpT、YebQ、YjhB、Bcr、FucP、WzxE、EmrE、Wzx、Blon_2331、Blon_2232、Blon_0247、Blon_0245、Blon_0345、NAPO、NAm、Nap、mdtD、YegB、Tcr_1_D38215、cmr、MFS、CDT2、rnd、类甜或阿拉伯糖外流膜蛋白中任何一种具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的蛋白。35.根据权利要求2或3中任一项所述的方法，其中所述P
‑
P键水解驱动的转运蛋白选自：具有SEQ ID NO 28的来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)菌株SRCM103457的LmrA，具有SEQ ID NO 30的来自大肠杆菌菌株K12 MG1655的OppF，具有SEQ ID NO 36的来自幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)(菌株ATCC 700392/26695)的Wzk，具有SEQ ID NO 44的来自长双歧杆菌婴儿亚种(菌株ATCC 15697)的Blon_2475，具有SEQ ID NO 68或72的来自斯巴达黄杆菌的LpsE，具有SEQ ID NO 70或74的来自球形鼠孢菌DSM 2875的LpsE，具有SEQ ID NO 76的来自Candidatus Planktophila sulfonica的TolC，具有SEQ ID NO 78的来自亨盖特丁酸弧菌(Butyrivibrio hungatei)XBD2006的TolC，具有SEQ ID NO 80的来自肠道罗斯拜瑞氏菌(Roseburia intestinalis)CAG：13的MsbA，具有SEQ ID NO 82的来自Pedobacter ginsengisoli的MsbA，具有SEQ ID NO 84的来自疣微菌门细菌CG1_02_43_26的MsbA，具有SEQ ID NO 174的来自根瘤菌属物种Root149的Wzm，具有SEQ ID NO 176的来自巴西固氮螺菌LMG 04375的Wzm，具有SEQ ID NO 196的来自大肠杆菌113303的Wzm，具有
SEQ ID NO 178的来自根瘤菌属物种Root149的Wzt，具有SEQ ID NO 180的来自巴西固氮螺菌LMG 04375的Wzt，具有SEQ ID NO 194的来自大肠杆菌113303的Wzt，具有SEQ ID NO 188或190的来自日本慢生根瘤菌USDA 110的Nodj，具有SEQ ID NO 206的来自大肠杆菌K
‑
12 MG1655的malE，具有SEQ ID NO 208的来自大肠杆菌K
‑
12 MG1655的malK，具有SEQ ID NO 214的来自大肠杆菌K
‑
12 MG1655的araF，具有SEQ ID NO 216的来自大肠杆菌K
‑
12 MG1655的xylF或具有SEQ ID NO 218的来自大肠杆菌K
‑
12 MG1655的ytfQ，或者上述P
‑
P键水解驱动的转运蛋白膜蛋白中任何一种的功能同源物或功能片段，或者具有与分别具有SEQ ID NO 28、30、36、44、68、72、70、74、76、78、80、82、84、174、176、196、178、180、194、188、190、206、208、214、216或218的所述LmrA、OppF、Wzk、Blon_2475、LpsE、TolC、MsbA、Wzm、Wzt、No...

【专利技术属性】
技术研发人员：J，
申请(专利权)人：因比奥斯公司，
类型：发明
国别省市：