【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
专利
本专利技术属于合成生物学、代谢工程和细胞培养的。本专利技术涉及新鉴定的唾液酸转移酶，其对乳糖的半乳糖残基具有α-2,3-唾液酸转移酶活性。本专利技术还描述了使用所述新鉴定的唾液酸转移酶中的任一种产生3’唾液酸化寡糖的方法以及所述3’唾液酸化寡糖的纯化。本专利技术还提供了用于产生所述3’唾液酸化寡糖的细胞以及所述细胞在培养或孵育中的用途。
技术介绍
1、迄今为止已经鉴定了超过150种结构上不同的人乳寡糖(hmo)。尽管hmo只代表了人乳总营养成分的一小部分，但在过去几十年中hmo对母乳喂养婴儿的发育的有益作用变得显而易见。
2、在hmo中，观察到唾液酸化hmo(shmo)支持如本领域中描述的几种有益作用。在人乳中的唾液酸化寡糖中，3’唾液酸乳糖、6’唾液酸乳糖、唾液酸乳糖-n-四糖a、唾液酸乳糖-n-四糖b、唾液酸乳糖-n-四糖c和二唾液酸乳糖-n-四糖是最普遍的成员。
3、唾液酸化寡糖被发现是一种复杂的结构并且其化学或(化学)酶合成已被证明具有挑战性：存在重重困难，例如立体化学的控制、特定键合的形成、原料的可用性等。因此，已经开发了可替代产生方法，其中已在微生物代谢工程方面进行了努力以产生唾液酸化寡糖。
4、迄今为止已经鉴定和表征了几种唾液酸转移酶，其来自细菌物种(例如来自奈瑟菌(neisseria)、弯曲杆菌(campylobacter)、巴氏杆菌(pasteurella)、螺杆菌(helicobacter)和发光杆菌(photobacterium))，以及来自哺乳动物和病毒。基
5、描述
6、专利技术概述
7、本专利技术的一个目的是提供工具和方法，通过其可以产生、优选地以高效、省时且成本有效的方式产生唾液酸化寡糖，优选3’唾液酸化寡糖，更优选3’唾液酸乳糖(3’sl、neu5ac-α2,3-gal-β1,4-glc)和/或3’kdo-乳糖，并且其产生大量所需的寡糖。
8、根据本专利技术，该目的和其他目的通过提供如本文中描述的新鉴定的唾液酸转移酶来实现的，所述唾液酸转移酶中的每一种都可以用于产生唾液酸化寡糖(优选3’唾液酸化寡糖，更优选3’sl和/或3’kdo-乳糖)的方法中。此外，所述新鉴定的唾液酸转移酶中的任一种可以在细胞中使用以用于产生唾液酸化寡糖，优选3’唾液酸化寡糖，更优选3’sl和/或3’kdo-乳糖。
9、更具体地说，本专利技术提供了新鉴定的唾液酸转移酶，其对乳糖(gal-β1,4-glc)的半乳糖(gal)残基具有α-2,3-唾液酸转移酶活性，并且包含在至少150个氨基酸残基、优选至少200个氨基酸残基的区段上与seq id no 05、01、02、03、06、07或08所示的氨基酸序列中的任一个至少67.0％相同的氨基酸序列，或者在至少150个氨基酸残基、优选至少200个氨基酸残基的区段上与seq id no 04所示的氨基酸序列至少85.0％相同的氨基酸序列，或者在至少150个氨基酸残基、优选至少200个氨基酸残基的区段上与seq id no 12所示的氨基酸序列至少60.0％相同的氨基酸序列。甚至更具体地说，本专利技术提供了新鉴定的唾液酸转移酶，其对乳糖(gal-β1,4-glc)的半乳糖(gal)残基具有α-2,3-唾液酸转移酶活性，并且包含与seq id no 05、04、12、01、02、03、06、07或08所示的全长氨基酸序列中的任一个至少80.0％相同的氨基酸序列。
10、本专利技术还提供了用于产生唾液酸化寡糖，优选3’唾液酸化寡糖，更优选3’sl和/或3’kdo-乳糖的方法和细胞。本专利技术还提供了用于纯化所述唾液酸化寡糖(优选3’唾液酸化寡糖，更优选3’sl和/或3’kdo-乳糖)的方法。此外，本专利技术提供了一种细胞，该细胞用本文中描述的所述新鉴定的唾液酸转移酶中的任一种进行代谢工程化并且其包含用于产生所述唾液酸化寡糖(优选3’唾液酸化寡糖，更优选3’sl和/或3’kdo-乳糖)的途径。
11、定义
12、用于本说明书中以描述本专利技术的词语及其各种实施方案应不仅以其通常所定义的含义来理解，而且应包括在通常所定义含义的范围以外的在本说明书中特定定义的结构、材料或作用。因此，如果元件在本说明书的上下文中可理解为包括多于一个含义，则其在权利要求中的使用必须理解为由本说明书和词语自身支持的一般至所有可能含义。
13、本文公开的本专利技术的各个方面和实施方案不仅应当按照本说明书中具体描述的顺序和上下文来理解，而且还包括其任何顺序及其任何组合。除非另有说明，本文所标识的每个实施方案可以组合在一起。本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体地且单独地表明通过引用整体并入一样。
14、只要上下文需要，除非另有明确说明，将认为以单数形式使用的所有词语包括复数形式，并且反之亦然。除非另外规定，否则本文中所用的所有技术和科学术语一般具有与本专利技术所属
中技术人员通常所理解相同的含义。一般而言，本文所使用的命名法及本文所描述的细胞培养、分子遗传学、有机化学和核酸化学以及杂交中的实验程序是本领域中熟知且常用的那些。使用标准技术进行核酸和肽合成。一般而言，酶反应和纯化步骤根据制造商说明书进行。
15、在本说明书中，已公开本专利技术的实施方案，并且尽管采用特定术语，但所述术语仅以描述性意义使用并且并非出于限制本专利技术的范围的目的，本专利技术的范围阐述于以下权利要求书中。必须理解，所说明的实施方案仅出于示例目的而阐述，且不应视为限制本专利技术。对于本领域技术人员将明显的是，改变、其他实施方案、改良、细节和用途可与本公开内容的文字和精神一致地并且在本公开内容的范围内作出，本公开内容的范围仅受权利要求书限制，权利要求书根据专利法解释，包括等同原则。在以下权利要求书中，用于指定权利要求步骤的参考标号仅为便于描述而提供，并且并不意欲暗示进行所述步骤的任何特定顺序，除非另外具体说明。
16、在整个申请中，除非另外明确说明，否则特征“合成(synthesize)”、“合成的(synthesized)”和“合成(synthesis)”分别与特征“产生(produce)”、“产生的(produced)”和“产生(本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于产生3’唾液酸化寡糖的方法，所述方法包括：使唾液酸转移酶与包含供体和受体的混合物在所述唾液酸转移酶催化唾液酸残基从供体转移到受体的条件下接触，所述供体包含唾液酸残基，所述受体选自包含寡糖或二糖的列表，从而产生所述3’唾液酸化寡糖，其中所述唾液酸转移酶对乳糖的半乳糖(Gal)残基具有α-2,3-唾液酸转移酶活性，并且包含与SEQ ID NO 05、04、12、01、02、03、06、07或08所示的全长氨基酸序列中的任一个至少80.0％相同的氨基酸序列，
2.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括：将包含所述唾液酸转移酶的细胞提取物与包含含有唾液酸残基的供体和含有寡糖或二糖的受体的混合物在所述唾液酸转移酶催化唾液酸残基从供体转移到受体的条件下接触，从而产生所述3’唾液酸化寡糖。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中所述3’唾液酸化寡糖是在无细胞系统中产生的。
4.一种用于产生3’唾液酸化寡糖的方法，所述方法包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述细胞是代谢工程化细胞，优选地其中所述细胞被代谢工程化以
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述唾液酸残基选自Neu4Ac；Neu5Ac；Neu4,5Ac2；Neu5,7Ac2；Neu5,8Ac2；Neu5,9Ac2；Neu4,5,9Ac3；Neu5,7,9Ac3；Neu5,8,9Ac3；Neu4,5,7,9Ac4；Neu5,7,8,9Ac4；Neu4,5,7,8,9Ac5；Neu5Gc和2-酮-3-脱氧甘露辛酮糖酸(KDO)中的至少一种。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述包含唾液酸残基的供体是CMP-唾液酸，优选选自CMP-Neu5Ac、CMP-Neu4Ac、CMP-Neu5Ac9N3、CMP-Neu4,5Ac2、CMP-Neu5,7Ac2、CMP-Neu5,9Ac2、CMP-Neu5,7(8,9)Ac2、CMP-N-羟乙酰神经氨酸(CMP-Neu5Gc)和CMP-KDO。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述3’唾液酸化寡糖是3’唾液酸乳糖(3’SL，Neu5Ac-α2,3-Gal-β1,4-Glc)并且所述受体是乳糖。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述3’唾液酸化寡糖是用KDO修饰的糖，优选3’KDO-乳糖，并且所述受体是乳糖。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述3’唾液酸化寡糖是3’唾液酸乳糖和3’KDO-乳糖的混合物，并且所述受体是乳糖。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述唾液酸转移酶包含：
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法包括：
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述培养或孵育培养基包含
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述3’唾液酸化寡糖是从培养或孵育培养基和/或细胞中回收的。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法导致产生45g/L或更多、优选50g/L或更多、更优选60g/L或更多的3’唾液酸化寡糖。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法导致产生10g/L或更少、优选5g/L或更少、更优选1g/L或更少、甚至更优选0.5g/L或更少、甚至更优选0.4g/L或更少、甚至更优选0.3g/L或更少、甚至更优选0.2g/L或更少、最优选0.1g/L或更少的3’-KDO-乳糖。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法导致产生包含45g/L或更多、优选50g/L或更多、更优选60g/L或更多的3’唾液酸化寡糖以及10g/L或更少、优选5g/L或更少、更优选1g/L或更少、甚至更优选0.5g/L或更少、甚至更优选0.4g/L或更少、甚至更优选0.3g/L或更少、甚至更优选0.2g/L或更少、最优选0.1g/L或更少的被KDO修饰的糖的糖混合物，其中所述3’唾液酸化寡糖不是3’KDO-乳糖，优选所述3’唾液酸化寡糖是3’SL，所述被KDO修饰的糖优选是KDO-乳糖，更优选3’-KDO-乳糖。
18.一种用于产生3’唾液酸化寡糖的代谢工程化细胞，其中所述细胞已被代谢工程化以具有唾液酸转移酶，优选地表达唾液酸转移酶，其中所述唾液酸转移酶对乳糖的半乳糖(Gal)残基具有α-2,3-唾液酸转移酶活性，并且包含与SEQ ID NO 05、04、12、01、02、03、06、07或08所示的全长氨基酸序列中的任一个至少80.0％相同的氨基酸序列。
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【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种用于产生3’唾液酸化寡糖的方法，所述方法包括：使唾液酸转移酶与包含供体和受体的混合物在所述唾液酸转移酶催化唾液酸残基从供体转移到受体的条件下接触，所述供体包含唾液酸残基，所述受体选自包含寡糖或二糖的列表，从而产生所述3’唾液酸化寡糖，其中所述唾液酸转移酶对乳糖的半乳糖(gal)残基具有α-2,3-唾液酸转移酶活性，并且包含与seq id no 05、04、12、01、02、03、06、07或08所示的全长氨基酸序列中的任一个至少80.0％相同的氨基酸序列，
2.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括：将包含所述唾液酸转移酶的细胞提取物与包含含有唾液酸残基的供体和含有寡糖或二糖的受体的混合物在所述唾液酸转移酶催化唾液酸残基从供体转移到受体的条件下接触，从而产生所述3’唾液酸化寡糖。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中所述3’唾液酸化寡糖是在无细胞系统中产生的。
4.一种用于产生3’唾液酸化寡糖的方法，所述方法包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述细胞是代谢工程化细胞，优选地其中所述细胞被代谢工程化以用于产生所述3’唾液酸化寡糖。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述唾液酸残基选自neu4ac；neu5ac；neu4,5ac2；neu5,7ac2；neu5,8ac2；neu5,9ac2；neu4,5,9ac3；neu5,7,9ac3；neu5,8,9ac3；neu4,5,7,9ac4；neu5,7,8,9ac4；neu4,5,7,8,9ac5；neu5gc和2-酮-3-脱氧甘露辛酮糖酸(kdo)中的至少一种。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述包含唾液酸残基的供体是cmp-唾液酸，优选选自cmp-neu5ac、cmp-neu4ac、cmp-neu5ac9n3、cmp-neu4,5ac2、cmp-neu5,7ac2、cmp-neu5,9ac2、cmp-neu5,7(8,9)ac2、cmp-n-羟乙酰神经氨酸(cmp-neu5gc)和cmp-kdo。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述3’唾液酸化寡糖是3’唾液酸乳糖(3’sl，neu5ac-α2,3-gal-β1,4-glc)并且所述受体是乳糖。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述3’唾液酸化寡糖是用kdo修饰的糖，优选3’kdo-乳糖，并且所述受体是乳糖。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述3’唾液酸化寡糖是3’唾液酸乳糖和3’kdo-乳糖的混合物，并且所述受体是乳糖。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述唾液酸转移酶包含：
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法包括：
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述培养或孵育培养基包含
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述3’唾液酸化寡糖是从培养或孵育培养基和/或细胞中回收的。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法导致产生45g/l或更多、优选50g/l或更多、更优选60g/l或更多的3’唾液酸化寡糖。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其...
【专利技术属性】
技术研发人员：J·博普雷兹，T·德寇内，A·瓦考特兰，T·瓦哈格，
申请(专利权)人：因比奥斯公司，
类型：发明
国别省市：
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