使用过滤法从发酵液中纯化寡糖制造技术

一种从发酵液中纯化寡糖，优选中性人乳寡糖(HMO)或唾液酸化HMO的方法，该方法包括：

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用过滤法从发酵液中纯化寡糖
[0001]本专利技术涉及通过微生物发酵以工业规模生产寡糖。更具体而言，本专利技术涉及通过使用过滤方法从发酵液中纯化目标寡糖。

技术介绍

[0002]人乳是碳水化合物、脂肪、蛋白质、维生素、矿物质和微量元素的复杂混合物。碳水化合物级分是最丰富的固体级分，且其可进一步分为乳糖和更复杂的寡糖，即所谓的人乳寡糖(HMO)。
[0003]虽然乳糖被用作能量来源，但是复杂的寡糖不会被婴儿或成人代谢。复杂寡糖的级分占总碳水化合物级分的最高达10％，并且可能由超过150种不同的寡糖组成。这些复杂寡糖的存在和浓度是人类所特有的，因此不会大量地存在于其他哺乳动物(例如驯养的产奶动物)的乳汁中。尽管HMO仅占人乳总量的一小部分，但是在过去几十年中，其对母乳喂养的婴儿的发育所具有的非常有益的影响变得日益明显。
[0004]最重要的HMO是2
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岩藻糖基乳糖。其他重要的HMO是3
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岩藻糖基乳糖、二岩藻糖基乳糖、乳
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N
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四糖、乳
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N
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新四糖和乳
‑
N
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岩藻戊糖。除了这些中性寡糖之外，酸性HMO也存在于人乳中，酸性HMO包括3
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唾液酸乳糖、6
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唾液酸乳糖和唾液酸乳糖
‑
N
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四糖(例如LST
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a、LST
‑
b和LST
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c(表1))。由于HMO存在至少一个唾液酸部分，因此人乳中最高达20％的总HMO含量是酸性的。这些结构与上皮细胞表面糖缀合物的抗原决定部位(Lewis组织血型抗原)是密切相关的，并且HMO和上皮抗原决定部位之间的结构同源性解释了HMO抵御细菌病原体的能力(Weichert等人2013年,Nutr.Res.33:831；Weichert等人2016年,J.Virol.90:4843)。
[0005]人乳中存在复杂的寡糖早已为人所知，几十年来，HMO的生理功能一直是医学研究的主题(Gura 2014年,Science 345:747；Kunz&Egge 2017年,In McGuire,McGuire&Bode(编辑)Prebiotics and Probiotics in Human Milk,Elsevier,London,第3
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16页)。对于一些更丰富的HMO，已经确定了特定的功能(Bode 2012年,Glycobiology 22:147；Bode&Jantscher
‑
Krenn 2012年,Adv.Nutr.3S:383；Morrow等人2004年,J.Pediatr.145:297)。由于HMO在抑制传染性物质(细菌、病毒和细菌毒素)方面的生理能力、其在大脑发育方面产生的积极影响及其具有的益生元功能，因此非常需要在食品中，尤其是婴儿营养产品中包括HMO。表1提供了可通过本文公开的方法从发酵液中纯化出的HMO的概览。
[0006][0007][0008]表1：可通过本文公开的方法纯化的人乳寡糖的列表。
[0009]单个HMO的有限供应并且没有找寻到能够获得足够数量的这些分子的资源促进了以生成它们的化学合成为基础的工艺的发展。然而，HMO的化学合成，尤其是大规模生产应用于食品中的足够质量的HMO，已被证明是极具挑战性的。特别地，HMO的化学合成如2
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FL(WO 2010/115935 A)需要几种有害化学品，这可能会污染最终产品。
[0010]化学合成的缺陷促进了几种基于酶促和发酵的方法的发展(Miyazaki等人2010年,Methods Enzymol.480:511；Murata等人1999年,Glycoconj.J.16:189；Baumgartner等人2013年,Microb.Cell Fact.12:40；Lee等人2012年,Microb.Cell Fact.1:48；Albermann等人2001年,Carbohydr.Res.334:97；US 7,521,212 B1；Fierfort&Samain2008年,J.Biotechnol.134:216)。然而，这些方法产生了寡糖的复杂混合物，因此所需的产物被原材料(如乳糖)以及中间体、不需要的副产物(例如源自某些糖基转移酶的副活性的副产物)和来自发酵方法的底物(如蛋白质、多肽、有机酸和盐)污染。
[0011]目前从混合物中纯化单个寡糖的许多方法在技术上很复杂，难以扩大规模，而且
对于食品应用来说是不经济的。现已开发出工业规模工艺用于分别从乳清和糖蜜中纯化二糖乳糖和蔗糖，但这些方法包括多个复杂且以低产率获得产品的结晶步骤。然而，乳清和糖蜜是以“食品级”产品使用，远不及含有重组细菌或酵母的发酵液那么复杂和苛刻(就监管要求而言)。凝胶过滤色谱法是纯化复杂的寡糖(如通过微生物发酵生产的HMO)的最佳方法，但这种方法的缺点包括缺乏可放大性且不适合连续加工。因此凝胶过滤色谱法是不经济的，不能用于工业规模化生产HMO。
[0012]理论上，凝胶过滤色谱法是纯化复杂的寡糖(如通过微生物发酵生产的HMO)的最佳方法，但凝胶过滤色谱法的缺点包括缺乏可放大性和不适合连续加工。因此凝胶过滤色谱法是不经济的，不能用于工业规模化生产HMO。
[0013]在开发出通过微生物发酵生产HMO的有效方法和工艺之后，下一个合乎逻辑的步骤是开发有效的下游工艺以从培养液中分离HMO。
[0014]WO2015/049331A公开了一种纯化中性HMO的工艺。该工艺采用离子交换、电渗析和模拟移动床(SMB)色谱法，以实现对大量HMO的连续和高效纯化。与用于生产中性HMO的化学合成路线及其后续纯化不同，所记载的发酵和纯化方法允许提供不含有害化学品(例如痕量重金属和有机溶剂)的HMO。该纯化方法得到了固体形式(通过喷雾干燥)或作为浓缩糖浆的高度纯化的HMO产品，这可以用于食品应用中。
[0015]WO 2015/106943 A记载了一种用于纯化通过微生物发酵产生的中性HMO的简单工艺。该工艺使用阳离子交换、阴离子交换和纳滤和/或电渗析的组合方法，其可有效纯化大量中性HMO。与早期的用于将微生物发酵产生的中性HMO进行纯化的方法不同，该工艺不包括色谱分离步骤。该工艺产生固体形式的HMO，为喷雾干燥材料、结晶材料或过滤除菌浓缩物。所得的HMO不包含蛋白质和用于生产的重组微生物菌株所产生的材料，因此是食品、医疗食品和饲料(例如宠物食品)应用的理想选择。
[0016]WO 2016/095924 A记载了一种通过结晶纯化2
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FL的方法。HMO由微生物发酵产生，除去生物质后，通过纳滤和电渗析对其进行浓缩。最后，使用乙酸从还含有2
’
,3
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二
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...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种从发酵液中纯化目标寡糖的方法，该方法包括：
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提供一种发酵液，该发酵液含有目标寡糖、生物质、微生物细胞以及除目标寡糖以外的其他碳水化合物；
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从发酵液中除去微生物细胞，从而提供工艺流；
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使用纳滤膜对工艺流进行第一个过滤步骤，从而提供含有目标寡糖的滤液；
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使用纳滤膜对滤液进行第二个过滤步骤，从而提供含有目标寡糖的截留物；和
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使用电渗析从工艺流中除去盐，从而提供目标寡糖的纯化制剂。2.根据权利要求1所述的方法，其中通过使发酵液经历至少一个离心步骤和/或至少一个过滤步骤，以从发酵液中除去微生物细胞。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述至少一个过滤步骤是微滤，优选使用具有约500kDa的截留分子量、更优选约150kDa的截留分子量的膜进行微滤。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述工艺流经历至少一个超滤步骤，使用具有约50kDa的截留分子量，优选约30kDa的截留分子量，更优选10kDa的截留分子量的膜。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中在第一个过滤步骤中使用的所述纳滤膜具有约700道尔顿至约3,000道尔顿的截留分子量，优选约1,000和约2,000道尔顿的截留分子量。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中在第二个过滤步骤中使用的所述纳滤膜具有100道尔顿至1,000道尔顿的截留分子量，优选约150道尔顿和约500道尔顿的截留分子量，更优选约200和约300道尔顿的截留分子量。7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述目标寡糖是中性寡糖或唾液酸化寡糖，优选中性HMO或唾液酸化HMO，更优选HMO选自2
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岩藻糖基乳糖、3
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岩藻糖基乳糖、2
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,3
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二岩藻糖基乳糖、乳
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N
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三糖II、乳
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N
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四糖、乳
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N
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新四糖、乳
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N
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岩藻戊糖I、乳
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N
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新岩藻戊糖、乳
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N
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岩藻戊糖II、乳
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N
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岩藻戊糖III、乳
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N
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岩藻戊糖V、乳
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N
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新岩藻戊糖V，乳
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N
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二岩藻己糖I、乳
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N
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二岩藻己糖II、6
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半乳糖基乳糖、3
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半乳糖基乳糖、乳
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N
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己糖和乳
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N
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新己糖、3
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唾液酸乳糖、6
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唾液酸乳糖、唾液酸乳糖
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N
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四糖a、唾液酸乳糖
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N
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【专利技术属性】
技术研发人员：S，
申请(专利权)人：科汉森母乳低聚糖股份有限公司，
类型：发明
国别省市：