一种β-丙氨酸生产菌、构建方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种β

【技术实现步骤摘要】
一种
β
‑
丙氨酸生产菌、构建方法及应用


[0001]本专利技术涉及一种β
‑
丙氨酸生产菌、构建方法及应用，属于代谢工程领域。

技术介绍

[0002]β
‑
丙氨酸（3
‑
氨基丙酸）是一种非蛋白质氨基酸，存在于所有生物中。β
‑
丙氨酸作为泛酸的重要组成部分，是辅酶A和酰基载体蛋白合成的前体。以往的研究表明，在微生物体内，缺乏β
‑
丙氨酸合成途径是致命的，因为不能合成辅酶A。另外，β
‑
丙氨酸也可作为补品，被体内吸收后，可与组氨酸偶联形成二肽，在人体肌肉和脑组织中起重要作用。因此，β
‑
丙氨酸广泛应用于药物(如帕米膦酸和胍丙酸和巴尔)、饲料和食品添加剂等领域。
[0003]目前β
‑
丙氨酸的合成方法主要有化学催化法、酶法和微生物发酵法，其中化学催化法是工业生产β
‑
丙氨酸的主要方法。然而，以丙烯酰胺、丁二酰亚胺或β
‑
氨基丙腈为原料的化学催化法，由于环境和社会的压力，是不可持续的。因此，利用酶法和微生物发酵法生产β
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丙氨酸，引起了学者的兴趣。目前，许多生物的ADC被表征，然后被用于酶法生产β
‑
丙氨酸。虽然酶法合成β
‑
丙氨酸取得了很大进展，并初步满足了工业应用的需要，但微生物发酵法仍是一种很有前途的工业生产方法。β
‑
丙氨酸是以草酰乙酸和富马酸为前体合成的天门冬氨酸衍生物。在大肠杆菌中，草酰乙酸和富马酸可以通过三羧酸循环的还原/氧化分支来合成。因此通过TCA循环的还原途径合成β
‑
丙氨酸在理论产量和能量消耗方面更有优势。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的提供一种β
‑
丙氨酸生产菌、构建方法及应用，满足β
‑
丙氨酸工业应用的需要。
[0005]为实现本专利技术的上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种β
‑
丙氨酸生产菌，由如下方法构建获得：（1）以E. coli W3110为出发菌，将其基因组中panD基因的启动子替换为Trc启动子，得到重组菌株E. coli W3110/Trc
‑
panD，记为ALA1；（2）将源自Bacillus subtilis的外源基因panD整合入质粒pTrc99A中，得到质粒pTrc99A
‑
panD；将质粒pTrc99A
‑
panD导入ALA1中，增强panD基因的表达，得到重组菌株ALA1/pTrc99A
‑
panD，记为ALA2；（3）将ALA2基因组中的ppc基因的启动子替换为Trc启动子，得到重组菌株ALA2/Trc
‑
ppc，记为ALA3；（4）将ALA3基因组中的pykA基因敲除，得到重组菌株ALA3/
△
pykA，记为ALA4；（5）将ALA4基因组中的aspA基因敲除，得到重组菌株ALA4/
△
aspA，记为ALA5，即为所述β
‑
丙氨酸生产菌。
[0006]大肠杆菌中β
‑
丙氨酸生物合成途径及本专利技术涉及的基因工程改造示意图参见图1。首先，在出发菌E. coli W3110的基础上，用Trc启动子替换基因panD的原始启动子，促进天冬氨酸转化为β
‑
丙氨酸；再将Bacillus subtilis来源的panD整合到质粒pTrc99A质粒
中，并导入工程菌中，进一步促进天冬氨酸转化为β
‑
丙氨酸；然后，通过启动子替换，强化基因ppc的表达，增强天冬氨酸合成的前体草酰乙酸的供应；再通过敲除基因pykA，降低碳通量流入TCA循环；最后，通过敲除基因aspA阻断天冬氨酸降解为富马酸；最终得到β
‑
丙氨酸生产菌株。
[0007]本专利技术还涉及构建所述β
‑
丙氨酸生产菌的方法，所述方法如下：（1）运用CRISPR
‑
Cas9基因编辑技术，将出发菌E. coli W3110基因组中的panD基因的启动子替换成Trc启动子，得到重组菌株W3110/Trc
‑
panD，记为ALA1；（2）将源自Bacillus subtilis的外源基因panD整合入质粒pTrc99A中，得到质粒pTrc99A
‑
panD；将质粒pTrc99A
‑
panD导入步骤ALA1中，增强panD基因的表达，得到重组菌株ALA1/pTrc99A
‑
panD，记为ALA2；（3）运用CRISPR
‑
Cas9基因编辑技术，将ALA2基因组中的ppc基因的启动子替换为Trc启动子，得到重组菌株ALA2/Trc
‑
ppc，记为ALA3；（4）运用CRISPR
‑
Cas9基因编辑技术，将ALA3基因组中的pykA基因敲除，得到重组菌株ALA3/
△
pykA，记为ALA4；（5）运用CRISPR
‑
Cas9基因编辑技术，将ALA4基因组中的aspA基因敲除，得到重组菌株ALA4/
△
aspA，记为ALA5，即为所述β
‑
丙氨酸生产。。
[0008]具体的，步骤（1）Trc启动子核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0009]SEQ ID No.1序列如下：ttgacaattaatcatccggctcgtataatgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagacc具体的，步骤（2）外源基因panD核苷酸序列如SEQ ID No.2所示（编码氨基酸序列如SEQ ID No.3所示）。
[0010]SEQ ID No.2序列如下：atgtatcgaacaatgatgagcggcaagcttcacagggcaactgttacggaagcaaatctgaattatgtgggaagcattacaattgatgaagatctcattgatgcggtgggaatgcttcctaatgaaaaagtgcaaattgtgaataataataatggagcacgtctggaaacgtatattattcctggtaaacgcggaagcggcgtcatctgcttaaacggtgcagccgcacgccttgtacaggaaggagataaggtcattattatttcctacaaaatgatgtctgatcaagaagcggcaagccacgagccgaaagtggctgttttgaatgatcaaaacaaaattgaacaaatgctggggaacgaaccagcccgtacaattttgtagSEQ ID No.3序列如下：MYRTMMSGKLHRATVTEANLNYVG本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种β
‑
丙氨酸生产菌，由如下方法构建获得：以E. coli W3110为出发菌，将其基因组中panD基因的启动子替换为Trc启动子，得到重组菌株E. coli W3110/Trc
‑
panD，记为ALA1；将源自Bacillus subtilis的外源基因panD整合入质粒pTrc99A中，得到质粒pTrc99A
‑
panD；将质粒pTrc99A
‑
panD导入步骤ALA1中，增强panD基因的表达，得到重组菌株ALA1/pTrc99A
‑
panD，记为ALA2；将ALA2基因组中的ppc基因的启动子替换为Trc启动子，得到重组菌株ALA2/Trc
‑
ppc，记为ALA3；将ALA3基因组中的pykA基因敲除，得到重组菌株ALA3/
△
pykA，记为ALA4；将ALA4基因组中的aspA基因敲除，得到重组菌株ALA4/
△
aspA，记为ALA5，即为所述β
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丙氨酸生产菌。2.构建权利要求1所述β
‑
丙氨酸生产菌的方法，其特征在于所述方法如下：运用CRISPR
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Cas9基因编辑技术，将出发菌E. coli W3110基因组中的panD基因的启动子替换成Trc启动子，得到重组菌株W3110/Trc
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panD，记为ALA1；将源自Bacillus subtilis的外源基因panD整合入质粒pTrc99A中，得到质粒pTrc99A
‑
panD；将质粒pTrc99A
‑
panD导入步骤ALA1中，增强panD基因的表达，得到重组菌株ALA1/pTrc99A
‑
panD，记为ALA2；运用CRISPR
‑
Cas9基因编辑技术，将ALA2基因组中的ppc基因的启动子替换为Trc启动子，得到重组菌株...

【专利技术属性】
技术研发人员：柳志强，李波，张博，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：