一株全细胞催化提高莱鲍迪苷A含量的工程菌制造技术

本发明专利技术公开了一株全细胞催化提高莱鲍迪苷A含量的工程菌：采用重组质粒将编码β

【技术实现步骤摘要】
一株全细胞催化提高莱鲍迪苷A含量的工程菌


[0001]本专利技术涉及生物工程技术以及天然化合物的生物合成
，具体涉及多酶协同作用或利用多基因共表达大肠杆菌工程菌菌株全细胞催化水解甜菊糖苷粗提物提高其中莱鲍迪苷A含量的方法。

技术介绍

[0002]甜菊糖苷是从一种原产于南美州亚热带地区的菊科植物—甜叶菊(SteviarebaudianaBertoni)的叶片中提取的一类四环二萜化合物，甜叶菊最初是被当地居民作为甜味剂添加至食物中以改善风味(TanakaO.Steviol
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glycosides:newnaturalsweeteners[J].TrAC,TrendsAnalChem,1982,1(11):246
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248.)。后续研究表明，甜菊糖苷的甜度是蔗糖的40～300倍，但热量比蔗糖低，并且物理性质相当稳定，可耐高温、耐酸、耐光，是一种非常理想的甜味剂。除作为甜味剂被应用至食品加工行业外，甜菊糖苷还有抗糖尿病、抗癌、抗高血压、保护心脏、预防龋齿等多种药理功效(GuptaE,PurwarS,SundaramS,etal.NutritionalandtherapeuticvaluesofSteviarebaudiana：Areview[J].JMedPlantsRes,2013,7(46):3343
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3353.)。19世纪70年代甜叶菊被引入日本开始大面积被种植并流入市场被销售，之后很多欧洲国家和地区，逐渐将甜叶菊提取物作为蔗糖替代品应用至食品生产行业。粮农组织/世卫组织食品添加剂联合专家委员会(JointFAO/WHOExpertCommitteeonFoodAdditives,JECFA)(JECFA.JECFA201073rdMeeting
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Compendiumoffoodadditivespecifications.Steviolglycosides[R].JointFAO/WHOExpertCommitteeonFoodAdditives(JECFA),2011.)，欧盟食品科学委员会(ScientificCommitteeonFood,SCF)(SCF.Opiniononsteviosideasasweetener[R].ScientificCommitteeOnFood(SCF),1999.)，澳大利亚及新西兰食品标准局(FoodStandardAustralianewZealand,FSANZ)，欧洲食品安全局(EuropeanFoodSafetyAuthority,EFSA)(EFSA.Scientificopiniononthesafetyofsteviolglycosidesfortheproposedusesasafoodadditive[J].EFSAJ,2010,8(4):1537
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1621.)相继制作了相关规定，批准总苷含量不低于95％的甜菊糖苷可以作为食品添加剂使用，并且规定容许每日摄取量(Acceptabledailyintake,ADI)为不超过4mg/每千克体重。甜菊糖苷也在我国的山东、福建、江苏、河南等20多个地区得到推广，现如今我国已成为甜叶菊种植大国及产品出口大国(万会达,李丹,夏咏梅.甜菊糖苷类物质的功能性研究进展[J].食品科学,2015,(17):264
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269.)。
[0003]甜菊糖苷是一类混合物，这类化合物有相同的贝壳杉烯酸(ent
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kaurenoic)骨架，即甜菊醇苷元。主要差别在于C
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13羟基糖苷键和C
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19羧基糖酯键所连接的糖基基团种类和数量不同，这导致它们的甜度、口感和其他理化性质都有较大差异(HansonJR,DeOliveiraBH.Steviosideandrelatedsweetditerpenoidglycosides[J].NatProdRep,1993,10(3):301
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309.)。甜菊糖苷混合物中含量最高的组分是甜菊苷，但它有绵长的后苦味，导致甜菊糖苷的应用受限；相比之下含量仅次之的莱鲍迪苷A甜度更高，且口感最
接近蔗糖；另外几种含量较高的组分如甜茶苷、莱鲍迪苷C和莱鲍迪苷B也有不同程度的后苦味，甜度都不及莱鲍迪苷A。因此，将甜菊糖苷混合物中有后苦味的几种组分去除以提高其中莱鲍迪苷A含量或者制备高纯度的莱鲍迪苷A成为当下的研究热点之一。马迎迎等人利用棘孢曲霉发酵酶液作用于5％(w/v)的甜菊糖苷24h，将其中的甜菊苷和莱鲍迪苷C转化成难溶于水的甜菊醇从溶液中离心分离。甜菊苷和莱鲍迪苷C转化率均达到100％，但其中的莱鲍迪苷B仍然保留，并且随着反应进行有部分莱鲍迪苷A被水解。(马迎迎,陈育如,张伟娜,等.棘孢曲霉转化甜菊糖为甜菊醇及纯化莱鲍迪苷A[J].微生物学报,2014,54(1):62
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68.)。Ha
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NulLee等人利用来源于Penicilliumdecumbens的β
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葡萄糖苷酶SPGase作用于2％(w/v)的甜菊糖苷96h，将其中的甜菊苷最终水解生成难溶于水的甜菊醇后从反应体系中离心分离，最后上清反应液中莱鲍迪苷A含量为84.86％(LeeHN,HongSJ,KangH,etal.Effectiverebaudiosideaseparationfromsteviaextractsbyenzymaticbioconversion[J].JournalofFoodProcessingandPreservation,2021,45(3):e15202.)
[0004]以莱鲍迪苷A或瑞鲍迪苷A(RebaudiosideA也常翻译为瑞鲍迪苷A)为专利技术名称查找国家知识产权局申请检索数据库，共检索到35项中国专利技术申请。在这些专利技术申请中，大多数是关于高纯度的莱鲍迪苷A的制备纯化的，这些专利技术申请都是以易获取的甜菊糖苷混合物为原料使用化学法或物理法分离制备高纯度的莱鲍迪苷A，主要是重结晶法、大孔树脂分离法以及分子印迹聚合物分离法等。但是大孔树脂分离法过程较为繁琐，树脂回收利用率低；重结晶过程中使用大量有机试剂(甲醇、乙醇、异丙醇、氯仿、丙酮等)导致后期溶剂处理困难，且容易污染环境，甚至产生副产物；而分子印迹聚合物分离法设备成本高，时间长，能耗高，回收率较低，并且由于各化合物间分子量十分接近，导致分离难度大。
[0005]由于物理或者化学法的局限性，生物法分离制备高纯度莱鲍迪苷A受到青睐。生物法之一是以易获取的甜菊苷为底物，利用糖基转移酶通过转糖苷作用合成莱鲍迪苷A，但是糖基化过程需要使用昂贵的糖基供体，成本高，而且通常会有较多副产物。因此利用廉价易获取的甜菊糖苷粗提物为原料，将其中除莱鲍迪苷A的其他几种含量较高但有后苦味的组分水解去除，以提高其中原有的莱鲍迪苷A的含量的方法则更加经济，容易实现。其中，专利技术申请CN101691389A利用巨大芽孢杆菌J2CCTCCNO:M209201发酵培养本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株全细胞催化提高莱鲍迪苷A含量的工程菌，其特征在于：采用重组质粒将编码β
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葡萄糖苷酶SBGL、SBGL2、SBGL3和α
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L
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鼠李糖苷酶SPRHA2的4个基因转入大肠杆菌中，并使这4个基因共表达，得到重组的大肠杆菌，即为全细胞催化提高莱鲍迪苷A含量的工程菌。2.一株如权利要求1所述全细胞催化提高莱鲍迪苷A含量的工程菌的构建方法，其特征在于，包含以下操作步骤：(1)设计0051
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F和0051
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R引物对，以重组质粒pQE
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sbgl2为模板PCR扩增得到目的基因片段sbgl2，连同重组质粒pRSF
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T7
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sbgl...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜丽琴，庞浩，文蔓蔓，兰青，席得志，李玲霞，管明东，林宇，韦宇拓，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：