【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物组织培养，具体涉及一种尾巨桉优良无性系dh32-28的植株再生方法。
技术介绍
1、尾巨桉(eucalyptus urophylla x e.grandis)，属于桃金娘科(myrtaceae)、桉属(eucalyptus)，具有速生、丰产、轮伐期短、木材产量高和固碳能力强等特性，是我国木材供应的主栽树种，也是南方种植的主要用材树种之一。尾巨桉优良无性系品种dh32-28由广西国有东门林场通过长年的杂交育种选育所得，目前已在广西大范围进行商业化种植。但随着桉树人工林的大面积种植，近年逐渐出现病虫害大爆发的以及受到霜冻等非生物胁迫的问题。因通过传统杂交育种选育高产抗逆新品种的周期往往较长。随着分子育种时代的到来，转基因和基因编辑作为新的林木遗传改良手段被推广应用于各种农林作物中，从而成为化解该困境的新途径。植株再生是转基因或基因编辑手段的基础，稳定高效的再生体系能为尾巨桉遗传转化体系的建立提供必要前提。自上个世纪九十年代开始，国内外桉树再生体系的研究都有一定的进展，研究内容涉及基因型、激素、外植体类型等多种影响因素。受限于以上这些因素，已建立的桉树再生体系无法直接应用于尾巨桉dh32-28无性系中，因此其高效再生体系仍需要探究，这为桉树分子育种打下坚实的基础，能进一步加快桉树遗传改良、基因功能研究进程，具有广阔的应用前景。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本专利技术提供一种优良无性系品种尾巨桉dh32-28的高效植株再生方法，该方法以尾巨桉dh32-28不带腋
2、为实现上述目的，本专利技术提供的技术方案如下：
3、一种尾巨桉优良无性系dh32-28的植株再生方法，包含以下操作步骤：
4、s1：采集尾巨桉dh32-28的枝条并进行消毒处理，获得无菌苗；
5、s2：获取增殖苗及伸长苗：将无菌苗接种到芽增殖培养基中培养，获得增殖苗；再将增殖苗接种到含ga3芽伸长培养基中进行伸长诱导，可使节间茎段得到显著伸长，获得伸长苗；
6、s3：取伸长苗的节间茎段作为外植体，接种到愈伤组织诱导培养基，获得愈伤组织；
7、s4：将愈伤组织接种到再生芽诱导培养基中进行再生芽的诱导；
8、s5：将诱导获得的有一定长度的再生芽接种到生根培养基中诱导生根，生根后的再生芽即为再生植株。
9、进一步地，在步骤s1中，所述尾巨桉枝条的采集为采集尾巨桉半木质化8～10cm的枝条，包含2～3个腋芽芽点，立即置于无菌水中保湿；消毒处理前，将枝条剪短至4～5cm，每个枝条含有1～2个腋芽芽点，若枝条中腋芽芽点旁存在侧枝或叶片，则应将侧枝或叶片剪短至0.5～1cm，在流水下冲洗2h；所述的消毒处理为在超净工作台中剪掉枝条的切口处组织，用体积浓度为75％的乙醇消毒30s，无菌水冲洗4次，然后用体积浓度为0.12％氯化汞消毒8min，期间摇晃数次，用无菌水冲洗5次后，将枝条置于无菌滤纸上晾干。
10、进一步地，在步骤s1中，用剪刀剪去枝条切口处组织，腋芽芽点的形态学上端枝条留的长度为0.3～0.5cm，形态学下端枝条留的长度为2～3cm，将枝条下端直立插入腋芽诱导培养基中，不要将枝条直接接触到培养基底部，当腋芽长至1cm时，将腋芽剪下，即为无菌苗；所述的腋芽诱导培养基为4.74g/l的ms培养基组分混合物中加入1mg/l 6-ba、0.1mg/lnaa、0.5g/l pvp40000、30g/l蔗糖，ph调为5.8，再加入7g/l琼脂。
11、进一步地，在步骤s2中，所述的芽增殖培养基为4.74g/l的ms培养基组分混合物中加入0.4mg/l 6-ba、0.2mg/l naa、0.5g/l pvp40000、30g/l蔗糖，ph调为5.8，加入7g/l琼脂。
12、进一步地，在步骤s2中，将增殖苗接种到含ga3芽伸长培养基中进行伸长诱导，所述诱导培养条件为光照强度22μmol/(m2·s)，光照12h/d，温度23±1℃；所述含ga3芽伸长培养基为4.74g/l的ms培养基组分混合物中加入0.4mg/l 6-ba、0.2mg/l naa、0.3mg/l ga3、0.5g/l pvp40000、30g/l蔗糖，ph调为5.8，加入7g/l琼脂。
13、进一步地，在步骤s3中，取尾巨桉dh32-28伸长苗的节间茎段，用无菌手术刀切掉茎段两端有腋芽的节点，再将茎段横切成0.3～0.5cm的外植体，将其以平躺的方式接触培养基，接种到愈伤组织诱导培养基中，培养7～30天(最优为20天)。
14、进一步地，在步骤s3中，所述的愈伤组织诱导培养基为2.47g/l的1/2ms培养基组分混合物中加入0.220mg/l tdz、0.019mg/l naa、30g/l蔗糖、7g/l琼脂，ph为5.8；愈伤组织诱导条件为黑暗培养，温度23±1℃，每15天继代一次。
15、进一步地，在步骤s4中，所述的再生芽诱导培养基为2.47g/l的1/2ms培养基组分混合物中加入0.25mg/l 6-ba、0.125mg/l naa、30g/l蔗糖、7g/l琼脂，ph为5.8；再生芽诱导条件为光照强度10μmol/(m2·s)，光周期12h/d，温度23±1℃。
16、进一步地，在步骤s5中，将诱导后长到1cm的再生芽接种到生根培养基中诱导生根；所述的生根培养基为2.47g/l的1/2ms培养基组分混合物中加入0.5mg/l iba、30g/l蔗糖、6g/l琼脂，ph为5.8；生根培养条件为光照强度22μmol/(m2·s)，光照12h/d，温度23±1℃。
17、与现有技术相比，本专利技术的有益效果：
18、本专利技术以尾巨桉优良无性系品种dh32-28不带腋芽的伸长苗茎段作为外植体，采用含ga3(赤霉素)芽伸长培养基显著增加增殖苗节间茎段及单个节间茎段再生芽的数量，以及在愈伤诱导和芽再生培养基中采用独特的激素配方，得到一种尾巨桉dh32-28高效植株再生方法，再生植株生根率100％，再生植株移栽成活率高达93％；本专利技术的方法能快速、有效的对尾巨桉dh32-28进行植株再生，操作简便，便于通过无性繁殖进行苗木的大批量生产。
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1.一种尾巨桉优良无性系DH32-28的植株再生方法，其特征在于，包含以下操作步骤：
2.根据权利要求1所述尾巨桉优良无性系DH32-28的植株再生方法，其特征在于：在步骤S1中，所述尾巨桉枝条的采集为采集尾巨桉半木质化8～10cm的枝条，包含2～3个腋芽芽点，置于无菌水中保湿；消毒处理前，将枝条剪短至4～5cm，每个枝条含有1～2个腋芽芽点，若枝条中腋芽芽点旁存在侧枝或叶片，则应将侧枝或叶片剪短至0.5～1cm，在流水下冲洗2h；所述的消毒处理为在超净工作台中剪掉枝条切口处组织，用体积浓度为75％的乙醇消毒30s，无菌水冲洗4次，然后用体积浓度为0.12％氯化汞消毒8min，期间摇晃数次，用无菌水冲洗5次后，将枝条置于无菌滤纸上晾干。
3.根据权利要求1所述尾巨桉优良无性系DH32-28的植株再生方法，其特征在于：在步骤S1中，剪去枝条切口处组织，腋芽芽点的形态学上端枝条留的长度为0.3～0.5cm，形态学下端枝条留的长度为2～3cm，将枝条下端插入腋芽诱导培养基中，当腋芽长至1cm时，将腋芽剪下，即为无菌苗；所述的腋芽诱导培养基为4.74g/L的MS培
4.根据权利要求1所述尾巨桉优良无性系DH32-28的植株再生方法，其特征在于：在步骤S2中，所述的芽增殖培养基为4.74g/L的MS培养基组分混合物中加入0.4mg/L 6-BA、0.2mg/L NAA、0.5g/L PVP40000、30g/L蔗糖，pH调为5.8，加入7g/L琼脂。
5.根据权利要求1所述尾巨桉优良无性系DH32-28的植株再生方法，其特征在于：在步骤S2中，将增殖苗接种到含GA3芽伸长培养基中进行伸长诱导，所述诱导培养条件为光照强度22μmol/(m2·s)，光照12h/d，温度23±1℃；所述含GA3芽伸长培养基为4.74g/L的MS培养基组分混合物中加入0.4mg/L6-BA、0.2mg/L NAA、0.3mg/L GA3、0.5g/L PVP40000、30g/L蔗糖，pH调为5.8，加入7g/L琼脂。
6.根据权利要求1所述尾巨桉优良无性系DH32-28的植株再生方法，其特征在于：在步骤S3中，取伸长苗的茎段，切掉茎段两端有腋芽的节点，此茎段即为伸长苗的节间茎段，再将节间茎段横切成0.3～0.5cm的外植体，接种到愈伤组织诱导培养基中，培养7～30天。
7.根据权利要求1所述尾巨桉优良无性系DH32-28的植株再生方法，其特征在于：在步骤S3中，所述的愈伤组织诱导培养基为2.47g/L的1/2MS培养基组分混合物中加入0.220mg/L TDZ、0.019mg/L NAA、30g/L蔗糖、7g/L琼脂，pH为5.8；愈伤组织诱导条件为黑暗培养，温度23±1℃，每15天继代一次。
8.根据权利要求1所述尾巨桉优良无性系DH32-28的植株再生方法，其特征在于：在步骤S4中，所述的再生芽诱导培养基为2.47g/L的1/2MS培养基组分混合物中加入0.25mg/L6-BA、0.125mg/L NAA、30g/L蔗糖、7g/L琼脂，pH为5.8；再生芽诱导条件为光照强度10μmol/(m2·s)，光周期12h/d，温度23±1℃。
9.根据权利要求1所述尾巨桉优良无性系DH32-28的植株再生方法，其特征在于：在步骤S5中，将诱导后长到1cm的再生芽接种到生根培养基中诱导生根；所述的生根培养基为2.47g/L的1/2MS培养基组分混合物中加入0.5mg/L IBA、30g/L蔗糖、6g/L琼脂，pH为5.8。
...【技术特征摘要】
1.一种尾巨桉优良无性系dh32-28的植株再生方法，其特征在于，包含以下操作步骤：
2.根据权利要求1所述尾巨桉优良无性系dh32-28的植株再生方法，其特征在于：在步骤s1中，所述尾巨桉枝条的采集为采集尾巨桉半木质化8～10cm的枝条，包含2～3个腋芽芽点，置于无菌水中保湿；消毒处理前，将枝条剪短至4～5cm，每个枝条含有1～2个腋芽芽点，若枝条中腋芽芽点旁存在侧枝或叶片，则应将侧枝或叶片剪短至0.5～1cm，在流水下冲洗2h；所述的消毒处理为在超净工作台中剪掉枝条切口处组织，用体积浓度为75％的乙醇消毒30s，无菌水冲洗4次，然后用体积浓度为0.12％氯化汞消毒8min，期间摇晃数次，用无菌水冲洗5次后，将枝条置于无菌滤纸上晾干。
3.根据权利要求1所述尾巨桉优良无性系dh32-28的植株再生方法，其特征在于：在步骤s1中，剪去枝条切口处组织，腋芽芽点的形态学上端枝条留的长度为0.3～0.5cm，形态学下端枝条留的长度为2～3cm，将枝条下端插入腋芽诱导培养基中，当腋芽长至1cm时，将腋芽剪下，即为无菌苗；所述的腋芽诱导培养基为4.74g/l的ms培养基组分混合物中加入1mg/l 6-ba、0.1mg/l naa、0.5g/l pvp40000、30g/l蔗糖，ph调为5.8，再加入7g/l琼脂。
4.根据权利要求1所述尾巨桉优良无性系dh32-28的植株再生方法，其特征在于：在步骤s2中，所述的芽增殖培养基为4.74g/l的ms培养基组分混合物中加入0.4mg/l 6-ba、0.2mg/l naa、0.5g/l pvp40000、30g/l蔗糖，ph调为5.8，加入7g/l琼脂。
5.根据权利要求1所述尾巨桉优良无性系dh32-28的植株再生方法，其特征在于：在步骤s2中，将增殖苗接种到含ga3芽伸长培养基中进...
【专利技术属性】
技术研发人员：韦利达，王建忠，徐增富，马宏伦，梁康明，黎明慧，倪军，李霞，冯名开，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：
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