一种生产N-乙酰氨基葡萄糖的菌株及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种生产N

【技术实现步骤摘要】
一种生产N-乙酰氨基葡萄糖的菌株及其构建方法和应用


[0001]本专利技术属于生物工程领域，涉及一种生产N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌株及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]N-乙酰氨基葡萄糖(N-Acetylglucosamine，GlcNAc)是生物体内多种多糖的组成单位，由葡萄糖的一个羟基被氨基取代形成，尤其是甲壳类动物的外骨骼含量最高，并广泛应用于食品、制药和化妆品行业。在食品行业，它可以作为食品抗氧化剂，婴幼儿食品添加剂，以及糖尿病患者甜味剂。在制药行业，它作为新型生化药品，在临床上是治疗风湿性及类风湿性关节炎的药物。同时它也主要用于临床增强人体免疫系统的功能，抑制癌细胞或纤维细胞的过度生长，对癌症和恶性肿瘤起到抑制和治疗作用。除此之外，N-乙酰氨基葡萄糖对于骨关节炎及关节疼痛也有治疗作用。在化妆品行业，它可以与D-葡萄糖醛酸形成高分子粘多糖生产透明质酸，有广阔的前景，市场巨大。
[0003]N-乙酰氨基葡萄糖的生产方法主要有化学法、酶催化法和微生物发酵法。化学法为通过酸水解甲壳素得到N-乙酰氨基葡萄糖，需要从蟹壳和虾壳中提取甲壳素，再经过酸水解得到氨基葡萄糖，之后利用浓盐酸水解N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰直接生成氨基葡萄糖，乙酸酐可使氨基葡萄糖乙酸化生产N-乙酰氨基葡萄糖。但该方法对环境不友好，同时污染大，且产品不适用于海鲜过敏症患者。与化学法相比，酶催化法和微生物发酵法属于环境友好型生产方法，但是酶催化法需要使用酶催化几丁质降解进而合成N-乙酰氨基葡萄糖，受制于底物虾蟹壳预处理困难、关键酶活性低、产物分离纯化困难，导致规模化生产难度较大。微生物发酵法生产N-乙酰氨基葡萄糖是目前最具前景的方法，也是本领域重点研究方向。
[0004]相对于40℃以下的低温发酵，高温发酵具有最小化污染的风险，提高原料转化速率，并且能够降低热交换成本等优势。到目前为止，关于微生物通过代谢工程改造生产N-乙酰氨基葡萄糖的报道中，发酵温度均为38℃及以下，没有高温生产N-乙酰氨基葡萄糖的专利及报道。因此，很有必要开发一种低成本的、强健的微生物平台来高温高产N-乙酰氨基葡萄糖。
[0005]嗜热细菌比如凝结芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌等，可以在高温条件下(40℃及以上)生长、并利用有机碳源(葡萄糖、木糖、阿拉伯糖等)进行发酵生产。例如其中的地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)ATCC 14580是一株兼性厌氧、革兰氏阳性、内生孢子型细菌，它能够利用各种五碳糖和六碳糖，具有较快的细胞生长速率，从而可以缩短发酵周期。它的遗传操作稳定并且是美国食品和药物管理局公认的GRAS(generally regarded as safe)菌株，并且该菌株可以在高达50℃的高温条件下进行高温发酵。这些优点表明菌株ATCC 14580可作为一株理想的平台菌株。

技术实现思路

[0006]为了解决上述问题，本专利技术提供一种可以在高温条件下生产N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌株及其构建方法和应用。本专利技术以嗜热地衣芽孢杆菌为例，通过消除地衣芽孢杆菌的N-乙酰氨基葡萄糖的分解代谢途径，引入N-乙酰氨基葡糖生产的代谢途径，实现N-乙酰氨基葡萄糖的胞外积累，使得N-乙酰氨基葡萄糖可以在高温条件下高效生产。本专利技术所提出的菌株构建思路可应用于多种产品的高温生产菌株的开发，所提出的菌株和发酵工艺在N-乙酰氨基葡萄糖的工业高温发酵生产方面具有良好的应用前景。
[0007]本专利技术的一个方面提供了一种生产N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌株，该基因工程菌株可以在40-50℃条件下发酵生产N-乙酰氨基葡萄糖。
[0008]进一步地，该基因工程菌株的起始菌为嗜热菌。
[0009]进一步地，该基因工程菌株的起始菌为芽孢杆菌。
[0010]优选地，该基因工程菌株的起始菌为地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、甲基营养芽孢杆菌、嗜热菊糖芽孢杆菌或嗜热脂肪地芽孢杆菌等。
[0011]优选地，该基因工程菌株的起始菌为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) ATCC 14580，所述地衣芽孢杆菌ATCC 14580可以从ATCC网站直接购买获得。
[0012]进一步地，该基因工程菌株为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BNGS1，保藏号为CCTCC NO:M2020054，于2020年3月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉，武汉大学。
[0013]进一步地，该基因工程菌株的起始菌中的N-乙酰氨基葡萄糖及N-乙酰氨基葡萄糖中间产物分解代谢和向胞内转运的途径被阻断。
[0014]优选地，该N-乙酰氨基葡萄糖及N-乙酰氨基葡萄糖中间产物分解代谢的途径，通过6-磷酸氨基葡萄糖脱氨酶nagB和gamA基因，6-磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶nagA基因中一种或多种的失活或缺失而被阻断；向胞内转运N-乙酰氨基葡萄糖的途径，通过N-乙酰氨基葡萄糖转运蛋白gamP和nagP基因中的一种或两种的失活或缺失而被阻断。
[0015]进一步地，该基因工程菌株中被引入过表达6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因和 6-磷酸氨基葡萄糖乙酰化酶基因。
[0016]进一步地，该6-磷酸氨基葡萄糖乙酰化酶基因序列如SEQ ID NO.1所示，该 6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因序列如SEQ ID NO.2所示。
[0017]优选地，该6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因可根据地衣芽孢杆菌全基因组DNA 序列GenBank No.NC_006270.3为模板通过PCR扩增得到。
[0018]优选地，该6-磷酸氨基葡萄糖乙酰化基因可根据酿酒酵母全基因组GenBankNo.NM_001179949获得，并进行密码子优化进行全基因合成。
[0019]本专利技术的另一方面还提供了如上所述的基因工程菌株的构建方法。在一个具体实施例中，该方法包括，使起始菌中的N-乙酰氨基葡萄糖分解代谢途径中的6
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磷酸氨基葡萄糖脱氨酶基因，6-磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶基因，以及N-乙酰氨基葡萄糖转运蛋白基因中的一种或多种失活或缺失；引入过表达6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因和6-磷酸氨基葡萄糖乙酰化酶基因。
[0020]进一步地，该方法包括以下步骤：
[0021]A.敲除起始菌中的6-磷酸氨基葡萄糖脱氨酶nagB和gamA基因，6-磷酸-N
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乙酰氨
基葡萄糖脱乙酰酶nagA基因，以及N-乙酰氨基葡萄糖转运蛋白gamP基因和nagP基因，得到敲除菌株；
[0022]B.构建6-磷酸氨基葡萄糖合成酶glmS基因以及6-磷酸氨基葡萄糖乙酰化酶 GNA1基因双表达载体；
[0023]C.将该双表达载体转入到步骤A所得到的敲除菌株中，得到生产N-乙酰氨基葡萄糖的该基因工程菌株。
[0024]进一步地，该双表达载体的构建方法为引入启动子，将表达载体与所述启动子，glmS基因，GNA1基因进行串联表达。
[002本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生产N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株在40-50℃条件下发酵生产所述N-乙酰氨基葡萄糖。2.根据权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株的起始菌为嗜热菌。3.根据权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株的起始菌为芽孢杆菌。4.根据权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株的起始菌为地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、甲基营养芽孢杆菌、嗜热菊糖芽孢杆菌或嗜热脂肪地芽孢杆菌。5.根据权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株的起始菌为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ATCC 14580。6.根据权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BNGS1，保藏号为CCTCC NO:M2020054，于2020年3月14日保藏于中国典型培养物保藏中心。7.根据权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株的起始菌中的N-乙酰氨基葡萄糖及N-乙酰氨基葡萄糖中间产物分解代谢途径和向胞内转运的途径被阻断。8.根据权利要求7所述的基因工程菌株，其特征在于，所述N-乙酰氨基葡萄糖及所述N-乙酰氨基葡萄糖中间产物分解代谢的途径，通过6-磷酸氨基葡萄糖脱氨酶nagB和gamA基因，6-磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶nagA基因中一种或多种的失活或缺失而被阻断；向胞内转运N-乙酰氨基葡萄糖的途径，通过N-乙酰氨基葡萄糖转运蛋白gamP和nagP基因中的一种或两种的失活或缺失而被阻断。9.根据权利要求7所述的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株中被引入过表达6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因和6-磷酸氨基葡萄糖乙酰化酶基因。10.根据权利要求8所述的基因工程菌株，其特征在于，所述6-磷酸氨基葡萄糖乙酰化酶基因序列如SEQ ID NO.1所示。11.根据权利要求9所述的基因工程菌株，其特征在于，所述6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因序列如SEQ ID NO.2所示。12.一种如权利要求1-11任一项所述的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，所述方法包括，使起始菌中的N-乙酰氨基葡萄糖分解代谢途径中的6-磷酸氨基葡萄糖脱氨酶基因，6-磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶基因，以及N-乙酰氨基葡萄糖转运蛋白基因中的一种或多种失活或缺失；引入过表达6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因和6-磷酸氨基葡萄糖乙酰化酶基因。13.一种如权利要求12所述的构建方法，其特征在于，所述包括以下步骤：A.敲除起始菌中的6-磷酸氨基葡萄糖脱氨酶nagB和gamA基因，6-磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶nagA基因，以及N-乙酰氨基葡萄糖转运蛋白gamP基因和nagP基因，得到敲除菌株；B.构建6-磷酸氨基葡萄糖合成酶glmS基因以及6-磷酸氨基葡萄糖乙酰化酶GNA1基因双表达载体；
C.将所述双表达载体转入到步骤A所得到的所述敲除菌株中，得到生产N-乙酰氨基葡萄糖的所述基因工程菌株。14.根据权利要求13所述的构建方法，其特征在于，所述双表达载体的构建方法为引入启动子...

【专利技术属性】
技术研发人员：许平，吴雨桐，陶飞，尚海涛，穆晓玲，张毅，段中岳，
申请(专利权)人：安徽银创生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：