生产脱环氧埃坡霉素B的重组菌及其用途制造技术

本发明专利技术涉及用于发酵生产脱环氧埃坡霉素B的重组纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)，该重组菌中埃坡霉素生物合成基因簇中的epoK基因被插入失活，以及使用所述重组菌生产脱环氧埃坡霉素B的方法。埃坡霉素B的方法。埃坡霉素B的方法。

【技术实现步骤摘要】
生产脱环氧埃坡霉素B的重组菌及其用途


[0001]本申请涉及重组细菌及其用途，更具体涉及生产脱环氧埃坡霉素B的重组纤维堆囊菌及其用途。

技术介绍

[0002]埃坡霉素(Epothilone)是一类由土壤微生物产生的作用于微管蛋白的具抗肿瘤活性的大环内酯类抗生素，于20世纪90年代初首先从粘细菌纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)中分离出来，主要有A和B两种产物，其结构如下。
[0003][0004]对纤维堆囊菌菌埃坡霉素生物合成基因簇中的基因的克隆分析表明，埃坡霉素聚酮合酶(polyketide synthases)利用酰基辅酶A为单位聚合形成微生物的次级代谢产物脱环氧埃坡霉素A和B，比例为2:1，其作为中间代谢产物再通过epoK基因产物细胞色素P450氧化酶的作用，最终分别形成环氧型的埃坡霉素A和B。在天然产生菌纤维堆囊菌中，脱环氧埃坡霉素A和B只以微量存在，远远低于终产物埃坡霉素A和B的产量，并且纤维堆囊菌发酵液中至少还有35种其它埃坡霉素类似物存在(Hardt，et al.,J Nat Prod 64:847-856，2001)。美国的Danishefsky研究小组对脱环氧埃坡霉素B成功地进行了化学全合成试验，但该全合成过程复杂、难于控制、产量低、成本高，从而大大降低了其药用开发价值。
[0005]由于非环氧化形式的脱环氧埃坡霉素B在毒性上远低于埃坡霉素的环氧化配对物，因此需要开发高效生产脱环氧埃坡霉素B的生产菌株，提高脱环氧埃坡霉素B的产量，以使其用于临床治疗。
[0006]美国专利US5843718和US6033883中描述了在重组宿主细胞内通过重组modular PKS基因而生产新型聚酮化合物，以及在宿主细胞体内，如链霉菌(Streptomyces)、大肠杆菌(E.coli)及粘细菌(Myxobacterial)中引入异源PKS基因而生产聚酮化合物的重组方法，在不能生产埃坡霉素的宿主细胞内，如链霉菌Streptomyces coelicolor和粘细菌Myxococcus xanthus中，通过引入异源埃坡霉素基因而生产埃坡霉素A和B已有报道(Tang,et al.Science 287:640-642；Julien&Shah,2002,Amtimicrobial.Agent Chemother.46(9):2772-2778，列于此以作参考)。
0.7％果糖、0.05-0.1％MgSO4.7H2O、和微量元素溶液5-10mg/L，且pH为7.1
±
0.3。
[0017]在一些具体的实施方案中，所述生产方法包括在发酵培养基中添加XAD-16树脂，例如2％-5％的XAD-16树脂，进行发酵生产。
[0018]在一些具体的实施方案中，在所述生产方法的发酵过程中进行每天分次补料。
[0019]在一些具体的实施方案中，所述生产方法还包括使用PC色谱柱和C色谱柱纯化脱环氧埃坡霉素B，所述纯化使用62-80％甲醇溶液洗脱，例如62％、67％、72％、77％、80％甲醇。
[0020]更具体地，脱环氧埃坡霉素B高产菌株BG03-09K发酵生产脱环氧埃坡霉素B的具体操作如下：
[0021]取保存-70℃以下超低温冰箱的菌种细胞冻存管培养至规定时间后转种在种子培养基中培育，将培养特征符合要求的种子液按照5
±
1％的接种比例，无菌转种至含有发酵培养基的发酵罐中，按照下述工艺参数进行分批补料培养14
±
2天。
[0022]发酵培养工艺参数：培养温度设定34℃，可接受范围34
±
1℃；pH设定7.1，可接受范围7.1
±
0.3，以酸碱溶液调节；溶氧控制设置点30％-50％，由进气量和搅拌转速协同控制，由消泡剂反馈消泡。发酵过程中分批补料，从第3
±
1天下午开始，每天分别补料2
±
1次，每次补加大豆蛋白胨溶液及果糖溶液。
[0023]在发酵第6天～发酵结束，逐日取样检测含量及镜检菌体生长状态及纯菌情况。以XAD树脂甲醇萃取液进行HPLC检测后分析计算发酵产量(见图1)。发酵产量应≥240mg/L，可高达500mg/L以上。
[0024]具体地，所述方法中，种子培养和发酵培养条件优选34℃，可接受范围34
±
1℃。
[0025]具体的，所述方法中，发酵培养条件优选pH设定7.1，可接受范围7.1
±
0.3。
[0026]具体的，所述方法中发酵培养条件优选在发酵时间3
±
1天开始，每天分别进行补料2
±
1次，补加大豆蛋白胨溶液及果糖溶液。
[0027]具体的，所述方法中，发酵培养条件优选通过分批流加补料延长发酵培养时间至14天
±
2天，可以获得更高的产量。
[0028]发酵培养结束后，将料液用100-200目筛网分离XAD树脂与菌体/菌液，拦截的XAD用等量水淋洗后装填至XAD树脂柱，用>90％甲醇洗脱XAD树脂，收集含有产品的甲醇洗脱液为XAD洗脱液。
[0029]将XAD洗脱液经脱脂棉过滤器，加水制备成约50％
±
5％(v/v)甲醇浓度的样品溶液加载至PC色谱柱(C18填料)上，用62-80％甲醇溶液洗脱，收集产品组分。
[0030]将上述PC柱处理后符合标准的收集液加纯化水制备成约50％
±
5(v/v)甲醇浓度的样品溶液，加载至C色谱柱(C18填料)上，用62-80％甲醇溶液洗脱，收集产品组分。C柱处理后符合标准的该收集液中脱环氧埃坡霉素B的HPLC纯度可达98％，其他单一杂质峰面积不得大于1.0％，PC柱和C色谱柱处理后总的回收产率大于70％。
[0031]在所述方法中，C柱处理后符合标准的收集液中脱环氧埃坡霉素B的HPLC纯度达98％，其他单一杂质峰面积不大于1.0％
附图说明
[0032]图1：BG03-09K发酵获得的产品的HPLC图。其中，脱环氧埃坡霉素A在4.4分钟附近
16，并用10ml的甲醇从XAD中洗脱埃坡霉素类代谢产物。HPLC分析发酵产物，获得一株命名为BG03-09K的重组菌能产生脱环氧埃坡霉素B，该菌以脱环氧埃坡霉素A/B为主要代谢产物，不产生埃坡霉素A/B(结果见图1)。
[0043]实施例二：菌株BG03-09K的保存性能
[0044]将适量BG03-09K培养液涂布在S42琼脂平板上，32℃下培养8天。然后从这个平板上挑取单个菌落,分别接种在含有3ml的灭菌BCF种子培养基的试管中，34℃摇床200rpm培养4天。选出其中一管生长茂盛的试管在显微镜下检测菌体有无杂菌，并转接在50ml的BCF种子培养基(250ml三角瓶)中，继续培养三天。在显微镜下检测菌体有无杂菌。取适量BCF培养液与90％甘油在无菌瓶中混合，取1-1.5ml混合液分装于标记本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于发酵生产脱环氧埃坡霉素B的重组菌纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)，该重组菌中埃坡霉素生物合成基因簇中的epoK基因是失活的。2.权利要求1所述的重组菌，其中所述epoK基因通过点突变、插入、缺失、取代而失活。3.前述任一项权利要求所述的重组菌，其是来自纤维堆囊菌So ce90(Sorangium cellulosum So ce90)的重组菌。4.前述任一项权利要求所述的重组菌，其中所述epoK基因通过插入而失活，所述epoK基因包含核苷酸序列SEQ ID NO.1，插入序列是SEQ ID NO.1的核苷酸基中第291位至第1960位。5.前述任一项权利要求所述的重组菌，该菌株生产以脱环氧埃坡霉素B为主要代谢产物的高产菌株。6.一种生产脱环氧埃坡霉素B的方法，包括在培养基中培养权利要求1至5任一项中所述的重组菌。7.权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐莉，邱荣国，
申请(专利权)人：成都华昊中天药业有限公司，
类型：发明
国别省市：