一种产门冬胰岛素融合蛋白的重组大肠杆菌发酵培养方法技术

本发明专利技术提供了一种适于重组大肠杆菌发酵产门冬胰岛素融合蛋白的培养基。具体地，本发明专利技术提供了一种包含酵母蛋白胨、酵母浸粉、甘油、Boc

【技术实现步骤摘要】
一种产门冬胰岛素融合蛋白的重组大肠杆菌发酵培养方法


[0001]本专利技术涉及微生物发酵领域，更具体地涉及一种产门冬胰岛素融合蛋白的重组大肠杆菌发酵培养方法。

技术介绍

[0002]糖尿病是一种常见的内分泌代谢疾病。目前全球范围内估计有4.63亿成年人(年龄在20-79岁之间)患有糖尿病，占该年龄段世界总人口的9.3％。到2030年与2045年，预计这一数字将分别达到5.78亿(10.2％)与7亿(10.9％)，我国目前拥有1.164亿(未计入港澳台数据)糖尿病患者，位于世界首位。糖尿病成为继心脑血管疾病、肿瘤之后的另一个严重的慢性疾病，糖尿病可以分为1型，2型和妊娠型三类。。
[0003]胰岛素一直被当作是治疗糖尿病并使血糖得到良好控制的重要药物。上世纪70年代，科技人员通过现代基因工程手段成功开发出了重组人胰岛素。后来，又相继开发出了各种胰岛素类似物，如门冬胰岛素、甘精胰岛素、赖脯胰岛素、地特胰岛素、德谷胰岛素、索马鲁肽、利拉鲁肽等。
[0004]目前，胰岛素是临床上治疗糖尿病最为有效、最为常用的药物，工业上主要利用基因工程菌发酵生产，该方法首先利用工程菌表达门冬胰岛素融合蛋白，然后对该融合蛋白进行进一步分离纯化获得胰岛素。对于门冬胰岛素融合蛋白，常用表达宿主有大肠杆菌和酵母菌。
[0005]大肠杆菌作为外源基因表达的宿主，遗传背景清楚，技术操作简单，培养条件简单，大规模发酵经济，它已成为应用最广泛，最成功的表达体系，它已成为多种蛋白的理想表达体系。
[0006]采用大肠杆菌表达外源蛋白技术在国内外已经比较成熟，大肠杆菌的大规模高密度发酵工艺在国内外也均已有报道，影响大肠杆菌工程菌培养及重组蛋白表达量的主要因素有培养基，培养条件，诱导条件和补料方式等。重组大肠杆菌培养基一般组成为碳源，氮源和矿物质。常用碳源有葡萄糖、甘油，常用氮源有酵母粉、蛋白胨、铵盐和硝酸盐等，常用矿物质有硫酸盐、钾盐、镁、锰、铁、锌、铜、钼、钙和氯化物等，大肠杆菌高密度发酵常采用半合成培养基，即在合成培养基中加入少量酵母粉，蛋白胨，以及少量无机盐和氨基酸。
[0007]然而，现有技术中的门冬胰岛素融合蛋白的发酵方法仍然存在表达量不高、诱导培养时间过长、生产效率不高等问题，本领域迫切需要开发新的产门冬胰岛素融合蛋白的重组菌发酵培养方法。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的在于提供一种产门冬胰岛素融合蛋白的重组大肠杆菌发酵培养基以及利用该培养基发酵产门冬胰岛素融合蛋白的方法。
[0009]在本专利技术的第一方面，提供了一种适用于重组大肠杆菌发酵的培养基，所述培养基包含酵母蛋白胨、酵母浸粉、甘油、Boc-L-赖氨酸、缓冲剂和微量元素；
[0010]其中，所述酵母蛋白胨的含量范围为10～25g/L培养基，所述酵母浸粉的含量范围为25～62.5g/L培养基，所述甘油的含量范围为3～11.25g/L培养基，所述Boc-L-赖氨酸的含量范围为0.4～1.3g/L培养基，以培养基体积计。
[0011]在另一优选例中，所述酵母蛋白胨的含量范围为11～15g/L培养基，所述酵母浸粉的含量范围为30～45g/L培养基，所述甘油的含量范围为4～8g/L培养基，所述Boc-L-赖氨酸的含量范围为0.5-1.1g/L培养基，以培养基体积计。
[0012]在另一优选例中，所述酵母蛋白胨的含量范围为12～14g/L培养基，以培养基体积计。
[0013]在另一优选例中，所述酵母浸粉的含量范围为37.5～42g/L培养基，以培养基体积计。
[0014]在另一优选例中，所述甘油的含量范围为5～6g/L培养基，以培养基体积计。
[0015]在另一优选例中，所述Boc-L-赖氨酸的含量范围为0.55～1.25g/L，较佳地为0.55～0.75g/L培养基，以培养基体积计。
[0016]在另一优选例中，所述培养基还包含硫酸铵。
[0017]在另一优选例中，所述硫酸铵的含量范围为0.5～2.0g/L，较佳地为0.8～1.5g/L培养基，以培养基体积计。
[0018]在另一优选例中，所述缓冲剂包括磷酸二氢钾和磷酸氢二钾。
[0019]在另一优选例中，所述磷酸二氢钾的含量范围为1～5g/L，较佳地为2.5～3g/L培养基，所述磷酸氢二钾的含量范围为3～10g/L，较佳地为4～8g/L培养基，以培养基体积计。
[0020]在另一优选例中，所述培养基的pH为6.8-7.4，较佳地为6.8-7.2。
[0021]在另一优选例中，所述微量元素包括：七水合硫酸亚铁、七水合硫酸锌、五水合硫酸铜、一水合硫酸锰、无水氯化钙、十水合四硼酸钠、四水合钼酸铵、或其组合。
[0022]在另一优选例中，微量元素母液中各组分的含量范围选自下组：
[0023]七水合硫酸亚铁10.0g/L，七水合硫酸锌2.3g/L，五水合硫酸铜1.0g/L，一水合硫酸锰0.5g/L，无水氯化钙2.9g/L，十水合四硼酸钠0.1g/L，四水合钼酸铵0.1g/L。
[0024]在另一优选例中，所述微量元素母液的溶剂为盐酸。
[0025]在另一优选例中，所述培养基含有酵母蛋白胨12～14g/L，酵母浸粉37.5～42g/L，磷酸二氢钾2.5～5g/L，磷酸氢二钾5～10g/L，硫酸铵1.0～2.0g/L，甘油3.75～6g/L，Boc-L-赖氨酸0.55～1.25g/L，微量元素母液3.75～7.5g/L。
[0026]在另一优选例中，所述培养基不含葡萄糖。
[0027]在本专利技术的第二方面，提供了一种利用本专利技术的第一方面所述的培养基进行发酵的方法，包括步骤：
[0028](1)提供一如本专利技术的第一方面所述的培养基；
[0029](2)将含有重组大肠杆菌的种子液接种到所述培养基中进行分批培养和补料培养；
[0030](3)向培养液中流加阿拉伯糖进行诱导培养，从而获得发酵产物。
[0031]在另一优选例中，所述方法用于发酵重组大肠杆菌生产融合蛋白，较佳地，所述融合蛋白为门冬胰岛素融合蛋白。
[0032]在另一优选例中，所述阿拉伯糖的浓度为150-250g/L，添加量为25-30mL。
[0033]在另一优选例中，在菌体的对数生长阶段开始诱导培养。
[0034]在另一优选例中，所述分批培养的培养温度为30-35℃，较佳地为32-34℃。
[0035]在另一优选例中，所述分批培养的培养时间为4-5h。
[0036]在另一优选例中，在分批培养发酵液的溶氧、pH快速上升时，开始补料培养。
[0037]在另一优选例中，所述补料培养的培养温度为36-38℃。
[0038]在另一优选例中，所述补料培养的培养时间为14-17h。
[0039]在另一优选例中，所述补料培养的碳源为甘油，较佳地，所述甘油的浓度为750.0mL/L(v/v)。
[0040]在另一优选例中，所述补料培养的氮源为酵母蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种适用于重组大肠杆菌发酵的培养基，其特征在于，所述培养基包含酵母蛋白胨、酵母浸粉、甘油、Boc-L-赖氨酸、缓冲剂和微量元素；其中，所述酵母蛋白胨的含量范围为10～25g/L培养基，所述酵母浸粉的含量范围为25～62.5g/L培养基，所述甘油的含量范围为3～11.25g/L培养基，所述Boc-L-赖氨酸的含量范围为0.4～1.3g/L培养基，以培养基体积计。2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述酵母蛋白胨的含量范围为11～15g/L培养基，所述酵母浸粉的含量范围为30～45g/L培养基，所述甘油的含量范围为4～8g/L培养基，所述Boc-L-赖氨酸的含量范围为0.5-1.1g/L培养基，以培养基体积计。3.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基还包含硫酸铵。4.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述缓冲剂包括磷酸二氢钾和磷酸氢二钾。5.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基的pH为6.8-7.4，较佳地为6.8-7.2。6.一种利用权利要求1所述的培养基进行发酵的方法，其特征在于，包括步骤：(1)提供一如权利要求1所述的培养基；(2)将含有重组大肠杆菌的种子液接种到所述培养基中进行分批培养和补料培养；(3)向培养液中流加阿拉伯糖进行诱导培养，从而获得发酵产物。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述分批培养的培养温度为30-35℃，较佳地为32-34℃。8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述补料培养的培养温度为36-38℃。9...

【专利技术属性】
技术研发人员：李克朗，张振山，吴松，刘慧玲，
申请(专利权)人：宁波鲲鹏生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：