本发明专利技术涉及一种高产胞苷的大肠杆菌突变株以及发酵生产胞苷的方法，属于发酵技术领域，该大肠杆菌突变株是通过诱变筛选获得的，其具有如下特征：①氨甲酰磷酸合成酶182位的丙氨酸突变为缬氨酸，948位的丝氨酸突变为苯丙氨酸；②天冬氨酸氨甲酰转移酶调节亚基86位的异亮氨酸、93位的甘氨酸、109位的半胱氨酸缺失；③尿苷酸激酶72位的天冬酰胺突变为丙氨酸，159位的天冬氨酸突变为天冬酰胺；④胞苷三磷酸合成酶147位天冬氨酸突变为谷氨酸，149位谷氨酸突变为丙氨酸。该突变株在50 L发酵罐中经过发酵，胞苷产量达到90±2 g/L，糖酸转化率可达30±1%，均为现有报道的最高值。
A mutant of colibacillus with high production of cytidine and the method of producing cytidine by fermentation
【技术实现步骤摘要】
一种高产胞苷的大肠杆菌突变株以及发酵生产胞苷的方法
本专利技术属于发酵
，具体地，涉及一种高产胞苷的大肠杆菌突变株以及发酵生产胞苷的方法。
技术介绍
胞苷是合成核糖核酸与脱氧核糖核酸的前体物质，参与了许多生命体内的反应。胞苷是重要的医药合成中间体，可以用来合成扎西他滨、卡培他滨、环胞苷、阿糖胞苷、阿扎胞苷、盐酸阿糖胞苷等抗病毒与抗肿瘤药物。因此，开发大批量、工业化、低成本高效的胞苷生产方法，满足医药领域对于胞苷原料的需求是一个重要的问题。生物发酵法合成胞苷主要依赖于微生物的发酵作用，所以生物发酵所选用的微生物种类就显得至关重要。自然条件下能够合成胞苷的菌株主要来源于大肠杆菌和枯草芽孢杆菌，但是胞苷合成量很低且无法控制。采用传统诱变或分子生物学方法可以提高菌株的胞苷生产能力。日本在胞苷合成菌种的培育上取得了较多成果，成功培育出了具有胞苷脱氨酶缺失、3-脱杂氮尿嘧啶抗性、5-氟胞苷抗性、氨甲酰磷酸合成酶活力增强以及高丝氨酸脱氢酶活力缺失等特性的枯草芽孢杆菌突变株，其最大胞苷产率稳定在30g/L左右(Bioscience,biotechnology,andbiochemistry,1996,60(2):353-354.)。国内在胞苷菌株选育方面也开始了相关工作，通过对大肠杆菌胞苷合成途径进行代谢工程改造，在5L发酵罐中实现了20g/L的胞苷产量(CN2017100038337)。胞苷高产菌株的选育难点在于解除氨甲酰磷酸合成酶、天冬氨酸氨甲酰转移酶、尿苷酸激酶、胞苷三磷酸合成酶受到的反馈调控。虽然通过酶的高级结构分析可以预测代谢物与酶的结合位点，但是与反馈调控相关的氨基酸位点却并不清楚。
技术实现思路
为了解决现有技术中的不足，本专利技术的目的一在于提供一种高产胞苷的大肠杆菌突变株，目的二在于提供利用所述大肠杆菌突变株发酵生产胞苷的方法。所述大肠杆菌突变株解除了氨甲酰磷酸合成酶、天冬氨酸氨甲酰转移酶、尿苷酸激酶、胞苷三磷酸合成酶受到的反馈调控，用于胞苷生产后，在50L发酵罐中的胞苷产量达到90±2g/L，较现有技术具有明显的提高。为了实现上述目的，本专利技术采用的具体方案为：一种高产胞苷的大肠杆菌突变株，所述大肠杆菌突变株具有如下特征：1、氨基酸序列如SEQIDNo.1所示的氨甲酰磷酸合成酶大亚基的第182位的丙氨酸突变为缬氨酸、第948位的丝氨酸突变为苯丙氨酸；2、氨基酸序列如SEQIDNo.5所示的天冬氨酸氨甲酰转移酶调节亚基第86位的异亮氨酸、第93位的甘氨酸和第109位的半胱氨酸缺失；3、氨基酸序列如SEQIDNo.9所示的尿苷酸激酶第72位的天冬酰胺突变为丙氨酸、第159位的天冬氨酸突变为天冬酰胺；4、氨基酸序列如SEQIDNo.13所示的胞苷三磷酸合酶第147位天冬氨酸突变为谷氨酸、第149位谷氨酸突变为丙氨酸。作为对上述方案的进一步优化，所述大肠杆菌突变株，分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)，保藏编号为CGMCCNo.19117，保藏日期为2019年12月9日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。本专利技术还提供一种利用所述大肠杆菌突变株进行胞苷发酵生产的方法，包括以下步骤：以所述大肠杆菌突变株为生产菌株，将生产菌株接种到含有6L种子培养基的10L发酵罐中进行种子培养，接种量为7-10％，培养温度为35-40℃，pH6.5-7.5，溶氧控制在20-40％，残糖控制在0.1-0.3％，培养周期为8-16h；种子培养完成后，接种到含有20L发酵培养基的50L发酵罐中进行胞苷发酵，接种量为10-15％，培养温度为35-40℃，pH6.5-7.5，溶氧控制在20-40％，残糖控制在0.1-0.3％，发酵周期为40-50h，发酵完成。作为对上述方案的进一步优化，所述种子培养基中含有的成分及其浓度分别为：葡萄糖30-50g/L、酵母粉2-8g/L、柠檬酸0.5-4g/L、蛋白胨1-7g/L、磷酸二氢钾1-5g/L、硫酸铵1-4g/L、硫酸镁0.5-2.0g/L、玉米浆5-20ml/L、硫酸亚铁10-40mg/L、硫酸锰1-4mg/L、氯化钴1-4mg/L、生物素1-4mg/L和VB11-4mg/L。作为对上述方案的进一步优化，所述发酵罐发酵培养基为：葡萄糖30-50g/L、酵母粉2-8g/L、柠檬酸0.5-4g/L、蛋白胨1-7g/L、磷酸二氢钾1-5g/L、硫酸铵1-4g/L、硫酸镁0.5-2.0g/L、玉米浆5-20ml/L、硫酸亚铁10-40mg/L、硫酸锰1-4mg/L、氯化钴1-4mg/L、生物素1-4mg/L和VB11-4mg/L。有益效果：1.本专利技术提供了一株用于胞苷生产的大肠杆菌突变株，并提供了氨甲酰磷酸合成酶、天冬氨酸氨甲酰转移酶、尿苷酸激酶、胞苷三磷酸合成酶中存在的突变位点。上述突变能够有效解除胞苷合成过程关键酶受到的反馈调节，为后续更高效的胞苷生产菌株选育提供了科学依据。2.本专利技术提供的用于胞苷生产的大肠杆菌突变株E.coliJL027，在50L发酵罐中的胞苷产量达到90±2g/L，糖酸转化率可达30±1％，均为现有报道的最高值。3.本专利技术提供的大肠杆菌突变株E.coliJL027，对核苷结构类似物的耐受性有了明显提高。出发菌株E.coliW3110ΔcddΔthrA对6-杂氮尿嘧啶、5-氟乳清酸、5-杂氮胞嘧啶、2-硫胞嘧啶的耐受性分别为100mg/L、120mg/L、80mg/L、50mg/L。E.coliJL027对6-杂氮尿嘧啶、5-氟乳清酸、5-杂氮胞嘧啶、2-硫胞嘧啶的耐受性分别为2.3g/L、3.4g/L、1.5g/L、1.2g/L。生物材料的保藏大肠杆菌突变株E.coliJL027，分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)，该菌株已于2019年12月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCCNo.19117。附图说明图1是大肠杆菌突变株的遗传性状和摇瓶发酵胞苷产量图；其中，cdd为胞苷脱氨酶基因、thrA为高丝氨酸脱氢酶基因、6AUr为6-杂氮尿嘧啶抗性、5FOAr为5-氟乳清酸抗性、5ACr为5-杂氮胞嘧啶抗性、2TCr为2-硫胞嘧啶抗性。具体实施方式所述大肠杆菌突变株是以一株积累嘧啶的大肠杆菌(E.coliW3110ΔcddΔthrA)为出发菌株，通过常压室温等离子体诱变(ARTP)和核苷结构类似物抗性筛选获得的。具体步骤如下：以E.coliW3110ΔcddΔthrA出发菌株进行第一轮次ARTP诱变，然后在含有100mg/L的6-杂氮尿嘧啶的培养基中筛选出菌株AU587；以AU587为出发菌株进行第二轮次ARTP诱变诱变，然后在含有150mg/L的5-氟乳清酸的培养基中筛选出菌株FA469；以FA469为出发菌株进行第本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种高产胞苷的大肠杆菌突变株，所述大肠杆菌突变株具有如下特征：1、氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的氨甲酰磷酸合成酶大亚基的第182位的丙氨酸突变为缬氨酸、第948位的丝氨酸突变为苯丙氨酸；2、氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的天冬氨酸氨甲酰转移酶调节亚基第86位的异亮氨酸、第93位的甘氨酸和第109位的半胱氨酸缺失；3、氨基酸序列如SEQ ID No.9所示的尿苷酸激酶第72位的天冬酰胺突变为丙氨酸、第159位的天冬氨酸突变为天冬酰胺；4、氨基酸序列如SEQ ID No.13所示的胞苷三磷酸合酶第147位天冬氨酸突变为谷氨酸、第149位谷氨酸突变为丙氨酸。/n
【技术特征摘要】
1.一种高产胞苷的大肠杆菌突变株，所述大肠杆菌突变株具有如下特征：1、氨基酸序列如SEQIDNo.1所示的氨甲酰磷酸合成酶大亚基的第182位的丙氨酸突变为缬氨酸、第948位的丝氨酸突变为苯丙氨酸；2、氨基酸序列如SEQIDNo.5所示的天冬氨酸氨甲酰转移酶调节亚基第86位的异亮氨酸、第93位的甘氨酸和第109位的半胱氨酸缺失；3、氨基酸序列如SEQIDNo.9所示的尿苷酸激酶第72位的天冬酰胺突变为丙氨酸、第159位的天冬氨酸突变为天冬酰胺；4、氨基酸序列如SEQIDNo.13所示的胞苷三磷酸合酶第147位天冬氨酸突变为谷氨酸、第149位谷氨酸突变为丙氨酸。
2.如权利要求1所述的一种高产胞苷的大肠杆菌突变株，其特征在于：所述大肠杆菌突变株，分类命名为大肠埃希氏菌（Escherichiacoli），保藏编号为CGMCCNo.19117，保藏日期为2019年12月9日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
3.利用如权利要求2所述的大肠杆菌突变株进行胞苷发酵生产的方法，包括以下步骤：以所述大肠杆菌突变株为生产菌株，将生产菌株接种到含有6L种子培养基的10L发酵罐中进行种子培养，接种量为7-10%，...
【专利技术属性】
技术研发人员：李静，李国栋，刘晓东，张孟涛，滕佳佳，张兆昆，宋会文，
申请(专利权)人：河南巨龙生物工程股份有限公司，郑州大学，
类型：发明
国别省市：河南;41
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。