本发明专利技术公开了一种生产γ-聚谷氨酸的重组谷氨酸棒杆菌及构建方法和应用，其特征是：是以野生型C.glutamicumATCC13869为出发菌株，转入含有γ-PGA合成酶复合体基因pgsBCA的重组表达质粒获得的工程菌。本发明专利技术的重组谷氨酸棒杆菌由于含有γ-PGA合成酶复合体基因pgsBCA，在生物素限制或添加Tween40发酵条件下，可以合成大量γ-PGA，降低γ-PGA生产过程中的谷氨酸添加成本，为更好地实现一步法生产γ-PGA的创新奠定基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种生产Y-聚谷氨酸的重组谷氨酸棒杆菌及构建方法和用途。
技术介绍
谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)最初由Kinoshita及其同事在土壤环境中分离得到，呈短杆至小棒状，有时微弯曲，两端钝圆，不分枝，单个或成八字排列，菌体0.7 0.9X 1.0 2.5微米，革兰氏阳性，无芽孢，不运动、菌落湿润、圆形，广泛存在于土壤、沟水、堆肥中及食品厂、酿酒厂、酱油厂、味精厂周围。在生物素限制、添加Tween40或盘尼西林等条件下，C.glutamicum通过磷酸烯醇式丙酮酸糖转运系统(PTS系统)利用葡萄糖、果糖、甘露糖和蔗糖作为碳源和能源用于生长和产谷氨酸(DominguezH,Lindley ND.Complete sucrose metabolism requires fruetose phosphotransferaseactivity in Corynebacterium glutamicum to ensure Phosphorylation in liberatedfructose.Appl Environ Microbiol, 1996，62:3878-3880.)DY-聚谷氨酸(Poly γ-glutamic acid, γ-PGA)是由D-谷氨酸和L-谷氨酸单体以Y-羧基与α-氨基以肽键的形式缩合而成的一种均聚氨基酸化合物，结构式如图1，分子量一般在100 IOOOkDa之间，相当于500 5000个左右的谷氨酸单体。作为一种生物高分子材料，Y-PGA具有生物可降解性好、可食、对人体和环境无毒害的优点，因此Y-PGA及其衍生物在食品、化妆品、医药和水处理等领域具有广泛的应用前景。Y-PGA具有良好的生物亲和性和生物降解性，可作为药物载体提高药物缓释性、靶向性和水溶性，降低药物毒副作用，是一类理想的可生物降解的医药用高分子材料(Duburel P, DekieLjSchacht E.Poly-l-glutamic acid derivatives as multifunctional vectors forgene delivery.Part A.Synthesis and physicochemical evaluation.Biomacromolecules, 2003,4(5):1168-1176.)。Y-PGA优良的生物相容性、生物降解性及无毒无污染性，使其在污水处理、食品工业、日用品工业及化工领域也具有良好的应用(Choi HJj Yang R, KuniokaM.Synthesis and characterization of pH-sensitive and biodegradable hydrogelsprepared by gamma irradiation using microbial poly (gamma-glutamic acid)andpoly (epsilon-lysine).Appl Polym Sci，1995，58:807-814.) 近几年来，由于人们环境意识的增强和国家可持续发展战略的要求，发展对环境友好材料和开发改善环境问题的产品成为一种产业上的趋势，它也推动了 Y -PGA产业化研究和探索的进程。早在1937年由研究人员首次在炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)的细胞荚膜中发现 Y -PGA( Ivnaovics G and Bruckner V.Chemishe undimmunologiche studieniiberden Mechanismus der milzbrandinfektin und immunitat;die chemische Strukturder Kapselsubstanz des Milzbrandbazillus und der serologisch identischenspezifischen Subtanz des Bazillus mesentericus.Z.1mmunitatsforschj 1937，90:304-318.)，此后微生物发酵法生产Y-PGA成为最具有工业化前景的生产方法。目前国内外主要选用以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtil is)为代表的微生物发酵法来生产Y-PGA。Kubota 等人(Kubota H.Production of poly ( y -glutamic acid)by Bacillussubtilis F-201.Biosci Biotechnol Biochem, 1993，57:1212-1213.)从土壤中分离得到一株B.subtilis F-201,其最高产量在最佳发酵条件下可达到50g/L,该菌株已经被日本明治制果株式会社(Meiji Seika Kaisha)成功用于工业化大规模生产γ-PGA。Ogawa等 A (Ogawa Y, Yamaguchi F，Yuasa K,Tahara Y.Efficient production of Y-polyglutamic acid by Bacillus subtilis (natto)in jar fermenters.Biosci BiotechnolBiochem, 1997，61:1684-1687.)对 B.subtilis MR141 进行发酵培养条件优化，使 Y -PGA最大产量达到 35g/L。Yoon 等(Yoon SH, Do JH, Lee SY, Chang HN.Production ofpoly-y-glutamic acid by fed—batch culture of Bacillus licheniformis.BiotechnolLett, 2000, 22(7):585-588.WfBacillus licheniformis ATCC9945a采用流加高密度培养方法，在2.5L发酵罐中发酵35小时后Y -PGA产量达到39g/L。此外，Y -PGA生产菌株还有B.subtilis IF03335、B.subtilis IF03336等。目前研究较多的Y-PGA生产菌株都是谷氨酸依赖型菌株，需要在培养基中加入谷氨酸或谷氨酸盐才能合成Y -PGA，因此在生产过程中降低成本及提高产量，是Y -PGA研究领域的重要课题之一。在筛选优质Y-PGA生产菌株方面，与传统诱变育种相比，基因工程定向育种手段有望成为提高Y-PGA产量的有效改造方式，近年来大量研究工作围绕Y-PGA合成酶复合体的研究展开。Ashiuchi 等人(Ashiuchi M, Soda K, Misono H.A poly- Y -glutamatesynthetic system of Bacillus subtilis IF03336:gene cloning and biochemicalanalysis of poly-y-glutamate produced by Escherichia coli clone cells.BiochemBiophys Res Cornrnun, 1999，263 (I): 6-本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种生产γ?聚谷氨酸的重组谷氨酸棒杆菌，其特征是：是以野生型C.glutamicum?ATCC13869为出发菌株，转入含有γ?PGA合成酶复合体基因pgsBCA的重组表达质粒获得的工程菌。
【技术特征摘要】
1.一种生产Y -聚谷氨酸的重组谷氨酸棒杆菌，其特征是:是以野生型c.glutamicumATCC13869为出发菌株，转入含有Y -PGA合成酶复合体基因pgsBCA的重组表达质粒获得的工程菌。2.—种权利要求1所述的生产Y-聚谷氨酸的重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征是:包括下列步骤:(I)构建含有Y -PGA合成酶基因pgsB、pgsC和pgsA的重组表达质粒；所述重组表达质粒是将pgsBCA基因插入E.coli/和C.glutamicum穿梭载体pEKEx2,得到的重组质粒pEKEx2 — BCA ； (2)将步骤(I)构建的重组表达质粒转化入C.glutamicumATCC13869 中。3.根据权利要求2所述的生产Y-聚谷氨酸的重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征是:步骤(I)的具体方法是:以枯草芽孢杆菌TKPG011基因组作为PCR模板，设计引物分别扩增PgsB、pgsC和pgsA,将pgsB片段两端分别接上BamHI和Hind III位点，引物为:正义链:5’ -gttgttggatccatgtggttactcattatagcctgtg-S’，反义链:5’ -gttgttaagcttcatgcttacgagctgcttaacc-3’，PCR 扩增参数如下:95°C 30s, 54°C 50s, 72°C lmin30s,共 30 个循环；将pgsC片段两端分别接上Hind III和NdeI位点，引物为:正义链:5’_gttgttaagcttctagatgttcggatcag-3’，反义链:5’ -gttgttcatatgcattaaattaagtggtaaac-3’，PCR 扩增参数如下:950C 30s, 56 V 40s, 72°C lmin,共30个循环；将pgsA片段两端分别接上NdeI和XbaI位点，引物为:正义链:5’ -gttgt...
【专利技术属性】
技术研发人员：姚文娟，孟国梁，张伟，陈向凡，殷润婷，
申请(专利权)人：南通大学，
类型：发明
国别省市：
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