集胞藻高效双同源重组载体及其构建方法与应用技术

本发明专利技术涉及具体涉及集胞藻高效双同源重组载体及其构建方法与应用。集胞藻高效双同源重组载体，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.8或SEQ?ID?NO.9所示。本发明专利技术还公开该集胞藻高效双同源重组载体的构建方法与应用。本发明专利技术所述集胞藻高效双同源重组载体在集胞藻PCC6803中过表达集胞藻PCC6803Delta?15、Delta15和Delta?6脂肪酸去饱和酶基因可明显提高集胞藻中十八碳四烯酸的含量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及具体涉及集胞藻高效双同源重组载体及其构建方法与应用，特别涉及一种集胞藻PCC6803遗传转化高效双同源重组载体及其构建方法与在集胞藻PCC6803脂肪酸合成中的应用，属于基因工程

技术介绍
蓝藻(cyanobacteria)又称蓝细菌，是一类能进行光合作用的原核生物。蓝藻细 胞可以利用简单的无机物合成有机物，所表达的外源基因产物不形成包含体，并且多数蓝藻及其提取物对人畜无毒，是转基因研究的良好受体。集胞藻PCC 6803 (Synechocystissp. strainPCC6803)做为一种单细胞蓝藻，具有生长速度快、培养条件简单、不产生毒素、细胞结构简单、遗传背景清楚、方便分子操作等特点，适合于利用广核生物反应器大规模生产，是很好的蓝藻基因工程受体。鉴于蓝藻表达的外源基因产物易纯化、不含毒素、藻细胞培养成本低且不容易污染等的优点，随着藻类基因工程的发展，使利用蓝藻作为外源基因表达载体以生产药物等高附加值产品成为可能。蓝藻基因改造大体分为三个阶段第一，外源DNA通过基因转移系统进入宿主细胞；第二，外源DNA在宿主细胞中稳定复制并得以表达；第三，外源DNA与宿主细胞染色体或内源质粒结合，或者在宿主细胞中进行自主复制。外源DNA进入蓝藻细胞在以下几种情况下可以稳定存在首先，外源基因重组进宿主染色体；其次，外源基因重组进宿主内源质粒；第三，外源基因以质粒形式存在并且能自主复制。同源重组分单交换形式和双交换两种类型。其中同源重组双交换载体是在外源基因两侧均有一段与宿主细胞染色体同源的片段，当重组质粒进入宿主细胞后，载体上外源基因两端的同源序列分别与宿主细胞内染色体的相应部位发生交换。这样，重组载体上的外源基因就随着同源序列进而整合进宿主细胞染色体上，载体上其余片段没有进入宿主细胞染色体中。所以，外源基因在外源基因的表达单元自带的调控元件的作用下表达或者在宿主染色体调控下表达。因为同源重组载体中不含蓝藻中复制的起始位点，所以在宿主细胞内会因为无法复制继而渐渐丢失。同源重组整合载体上没有能在藻细胞中自主复制的复制子，不能独立复制，但含有与宿主染色体同源序列,质粒载体进入宿主细胞以后,可通过与宿主细胞染色体同源序列发生同源重组单交换或者双交换，进而将外源基因整合到宿主细胞染色体上，以低拷贝数基因存在并表达。目前集胞藻PCC6803遗传转化方法已经很成熟，而其双同源重组载体构建方法种类繁多，但国内外对同源重组载体启动子兼做的上游臂且高效表达外源基因的报道很少。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种集胞藻PCC6803遗传转化高效双同源重组载体及其构建方法与在集胞藻PCC6803脂肪酸合成中的应用。本专利技术技术方案如下集胞藻高效双同源重组载体，核苷酸序列如SEQ ID NO. 8或SEQ ID NO. 9所示。上述集胞藻高效双同源重组载体的构建方法，步骤如下(I) PCR扩增集胞藻PCC 6803的psbA2基因ATG前510bp基因片段作为psbA2启动子基因片段、Genbank登录号为X13547.1的集胞藻PCC 6803的psbA20RF基因片段、Genbank登录号为U02439.1的大肠杆菌终止子T1T2基因片段、Genbank登录号为D13780.1的集胞藻PCC6803Deltal5脂肪酸脱氢酶基因片段和Genbank登录号为LI 1421.1的集胞藻PCC6803Delta6脂肪酸脱氢酶基因片段； (2)将步骤(I)获得的psbA2启动子基因片段分别与步骤(I)制得的集胞藻PCC6803Deltal5脂肪酸脱氢酶基因片段和集胞藻PCC6803 Delta6脂肪酸脱氢酶基因片段进行融合PCR扩增，分别制得基因片段Promotor+Delta 15和基因片段Promotor+Delta6 ；(3)将步骤(I)制得的大肠杆菌终止子T1T2基因片段用PstI和BamHI双酶切后与经相同酶切的pBluescript SK连接,得到质粒pBluescript SK T1T2 ；然后将步骤(I)制得的psbA20RF基因片段用SacII和SacI双酶切后与经相同酶切的质粒 pBluescript SK T1T2 连接,得到质粒 pBluescript SK TlT2-downstream ；对质粒pBluescript SK TlT2_downstream 和质粒 pUC4K 进行 BamHI 单酶切，电泳后分别回收pBluescript SK TlT2_downstream载体片段和pUC4K中的npt片段,对载体片段去磷酸化后与npt片段连接,得到质粒pBluescript SK TlT2-npt_downstream ;(4)将步骤(2)制得的基因片段Promotor+Deltal5，或者，基因片段Promotor+DeIta15 和基因片段 Promotor+Delta6 插入步骤(3)制得的质粒 pBluescriptSKTlT2-npt-downstream 中，制得重组载体；(5)将步骤(4)制得的重组载体转化至集胞藻PCC6803中，制得转基因集胞藻；(6)将步骤(5)制得的转基因集胞藻在20 30°C条件下通气培养8 12天，制得高脂肪酸含量的集胞藻PCC6803。根据本专利技术优选的，所述步骤(I)中，PCR扩增psbA2启动子基因片段的引物为 Promotor-F: 5，-GATGTCGACGCTTTAGCGTTCCAGTG-3，；Promotor-R :5’ -CATTTGGTTATAATTCCTTATGTAT-3’ ；扩增程序如下94°C预变性5min，94°C变性30s，55°C复性30s，72°C延伸30s，35个循环后，72°C 10min，4°C保存。根据本专利技术优选的，所述步骤(I)中，PCR扩增集胞藻PCC6803的psbA20RF基因片段，在其5’端引入SacII酶切位点，在其3’端引入SacI酶切位点，所用引物为psbA2-F:5’ -CTTCATATGCCGCGGATGACAACGACTCTCCAAC-3’ ；psbA2-R:5， -AGTGAGCTCTTAACCGTTGACAGCAGG-3，；扩增程序如下94°C预变性5min，94°C变性30s，60°C复性30s，72°C延伸lmin，35个循环后，72°C 10min，4°C保存。根据本专利技术优选的，所述步骤(I)中，PCR扩增集胞藻PCC6803Deltal5脂肪酸脱氢酶基因的引物为Syl5-F:5’ -TAAGGAATTATAACCAAATGCGTCTAGAAATTTCATCG-3’ ；Syl5-R:5’ -CGGCTGCAGTTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCAGGTTTCTTTTGATATC-3’ ；扩增程序如下94°C预变性5min，94°C变性30s，60°C复性30s，72°C延伸lmin，35个循环后，72°C 10min，4°C保存。根据本专利技术优选的，所述步骤(I)中，PCR扩增花生硫脂酶基因Delta6的引物为Sy6-F:5， _TAAGGAATTATAACCAAATGCTAACAGCGGAAAG_3，；Sy6-R:5， -GTCCTGCA本文档来自技高网...

【技术保护点】
集胞藻高效双同源重组载体，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.8或SEQ?ID?NO.9所示。

【技术特征摘要】
1.集胞藻高效双同源重组载体，核苷酸序列如SEQID NO. 8或SEQ ID NO. 9所示。2.权利要求1所述集胞藻高效双同源重组载体的构建方法，其特征在于，步骤如下 (1)PCR扩增集胞藻PCC6803的psbA2基因ATG前510bp基因片段作为psbA2启动子基因片段、Genbank登录号为X13547.1的集胞藻PCC 6803的psbA20RF基因片段、Genbank登录号为U02439.1的大肠杆菌终止子T1T2基因片段、Genbank登录号为D13780.1的集胞藻PCC6803Deltal5脂肪酸脱氢酶基因片段和Genbank登录号为L11421.1的集胞藻PCC6803Delta6脂肪酸脱氢酶基因片段； (2)将步骤(I)获得的psbA2启动子基因片段分别与步骤(I)制得的集胞藻PCC6803Deltal5脂肪酸脱氢酶基因片段和集胞藻PCC6803Delta6脂肪酸脱氢酶基因片段进行融合PCR扩增，分别制得基因片段Promotor+Delta 15和基因片段Promotor+Delta6 ； (3)将步骤(I)制得的大肠杆菌终止子T1T2基因片段用PstI和BamHI双酶切后与经相同酶切的pBluescript SK连接,得到质粒pBluescript SK T1T2 ； 然后将步骤(I)制得的psbA20RF基因片段用SacII和SacI双酶切后与经相同酶切的质粒 pBluescript SK T1T2 连接,得到质粒 pBluescript SK TlT2-downstream ； 对质粒pBluescript SK TlT2_downstream和质粒pUC4K进行BamHI单酶切，电泳后分别回收pBluescript SK TlT2_downstream载体片段和pUC4K中的npt片段，对载体片段去磷酸化后与npt片段连接,得到质粒pBluescript SK TlT2-npt-downstream ； (4)将步骤(2)制得的基因片段Promotor+DeltalS，或者，基因片段Promotor+DeIta15 和基因片段 Promotor+Delta6 插入步骤(3)制得的质粒 pBluescriptSKTlT2-npt-downstream 中，制得重组载体； (5)将步骤(4)制得的重组载体转化至集胞藻PCC6803中，制得转基因集胞藻； (6)将步骤(5)制得的转基因集胞藻在20 30°C条件下通气培养8 12天，制得高脂肪酸含量的集胞藻PCC6803。3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(I)中，PCR扩增psbA2启动子基因片段的引物为Promotor-F:5’ -GATGTCGACGCTTTAGCGTTCCAGTG-3’ ；Promotor-R :5’ -CATTTGGTTATAATTCCTTATGTAT-3’ ； 扩增程序如下94°C预变性5min，94°C变性30s，55°C复性30s，72°C延伸30s，35个循环后，72°C 10min，4°C保存。4.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(I)中，PCR扩增集胞藻PCC6803的psbA20RF基因片段，在其...

【专利技术属性】
技术研发人员：何庆芳，陈高，毕玉平，张燕，李伟智，杨连群，范仲学，边斐，马德源，彭振英，
申请(专利权)人：山东省农业科学院高新技术研究中心，
类型：发明
国别省市：