人白细胞介素-10的高效表达方法技术

本发明专利技术涉及人白细胞介素-10的高效表达方法。具体而言，本发明专利技术提供用于在酵母中表达外源蛋白的方法，其包括下述步骤：1)构建表达载体，所述表达载体包含rDNA非编码区，抗生素抗性基因，分泌信号肽和外源蛋白的编码序列；2)逐步增加抗生素的浓度，从而扩增所述表达载体的拷贝数，构建含有不同拷贝数的克隆的库；3)选择表达克隆，表达并回收外源蛋白。所述外源蛋白优选为人白细胞介素-10。本发明专利技术还涉及用于本发明专利技术的方法的表达载体，包含本发明专利技术的表达载体的酵母菌株，以及本发明专利技术的表达载体和酵母菌株的用途。通过本发明专利技术的方法可以容易地获得具有产业化价值的hIL-10高效表达菌株，进而表达回收人白细胞介素-10。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程
具体而言，本专利技术涉及一种由生物技术制备人白细胞介素-10(hIL-10)的方法，特别涉及一种毕赤酵母高效表达hIL-10的载体的构建方法和高效表达hi L-10菌株的筛选和建立。
技术介绍
hIL-10能抑制T细胞介导的免疫炎症反应和通过刺激B淋巴细胞反应而参与体液免疫调节，具有良好的临床应用前景。目前已应用于包括I型糖尿病、银屑病、类风湿关节炎、多发性硬化、丙型肝炎等多种免疫性疾病的临床实验研究。天然hIL-10主要由巨噬细胞产生的分子量为18.5KD，无糖基修饰，活性形式是由非共价键连接两个单体而形成的同源寡二聚体。国内外对hIL-10作用机制及临床治疗疾病的应用进行了广泛而深入的研究，一方面确认了 hIL-10生物学功能，另一方面也扩展了其临床应用范围；因此，市场对hIL-10的需要将越来愈大。目前国内外已报道hIL-10的重组表达系统主要有Ecoli，CH0-Kl，还有一些研究人员使用植物叶片表达；使用酵母表达hIL-10的相关工作也很少，关键是难以大量得到具有天然活性的同源寡二聚体。国际市场上重组hIL-10非常昂贵，且国内尚无企业生产。国际上商品化重组hIL-10主要是大肠杆菌来源的，具有161个氨基酸，比正常hIL-10多一个氨基酸，在治疗上具有潜在的危害。而大肠杆菌主要以包涵体的形式表达hIL-10，是无生物学活性的蛋白复合物，且变复性过程复杂，回收率低，严重影响了 hIL-10的研究和应用。本专利技术前，一些研究人员用invitrogen公司购买的常用毕赤酵母表达载体，如pPIC9K(刘立藏，马辉文等. 人白细胞介素10(hIL10)在毕赤酵母中的表达.武汉大学学报，2004，50(2)和井申荣，邹全明等.重组人白细胞介素10在毕赤酵母中的表达及生物学活性测定.中华微生物学和免疫学杂志，2005，25 (9))，pPICZ α A(陈富超，孙万邦等.重组hIL-10在毕赤酵母X-33的表达及其生物活性鉴定.中国免疫学杂志，2011,27(8))等，转化毕赤酵母表达菌株(如GS115, X-33等)，参照invitrogen公司推荐的毕赤酵母表达菌株的常规筛选方法。由于这些常规的的毕赤酵母表达载体获得高拷贝菌株的几率很低，而用PA0815载体(井申荣，邹全明等.白细胞介素-10基因多拷贝表达盒的构建及在毕赤酵母中的表达.中国生物制品学杂志，2007,20(2))的方法虽然也能获得高拷贝菌株，但这种方法十分费时费力，且结果不佳和不容易实现。同时，常规的筛选高效表达菌株是在温度为28-30°C下进行的，忽略了酵母分泌机制可能对重组蛋白表达的不利影响，导致外源表达蛋白在细胞内储留并造成酵母细胞生存力影响。因此，利用常规的筛选方法未能获得hIL-10的高效表达菌株。
技术实现思路
1.本专利技术的技术方案本专利技术一方面提供一种适用于酵母高效表达外源重组蛋白的方法，以及用于该方法的表达载体的构建方法。本专利技术另一方面提供一种hIL-10的酵母表达方法，以及用于所述方法的载体的构建方法。具体而言，本专利技术一方面提供用于在酵母中表达外源蛋白的方法，其包括下述步骤:I)构建表达载体，所述表达载体包含rDNA非编码区，抗生素抗性基因，分泌信号肽和外源蛋白的编码序列；2)逐步增加抗生素的浓度，从而扩增所述表达载体的拷贝数，构建含有不同拷贝数的克隆的库；3)选择表达克隆，表达并回收外源蛋白。在本专利技术的一个实施方案中，所表达的外源蛋白优选地是人白细胞介素-10。在本专利技术这一方面，利用rDNA在毕赤酵母基因组中的多拷贝特性，设计以rDNA的非编码区为整合 位点，可以在同一个克隆中同时转入多个表达载体，从而有利于获得外源基因的高效表达；同时，专利技术人发现，通过逐步增加抗生素的浓度，扩增所述表达载体的拷贝数，然后构建含有不同拷贝数的克隆的库，在此基础上选择表达克隆，可以容易地获得高拷贝菌株，进而表达和回收外源蛋白。优选地，专利技术人发现选择分散在酵母的4条染色体上的rDNA非编码区，可以在同一个克隆中同时转入多个表达载体，有利于获得外源基因的高效表达。更优选地，专利技术人发现使用序列为SEQ ID No:1的rDNA非编码区有利于高效地将外源基因的多个表达载体同时转入到一个克隆中，并且转化得到的高拷贝克隆稳定性好，可以容易地获得闻效表达的菌株。在本专利技术的一个实施方案中，所述方法进一步包括低温下甲醇诱导外源蛋白分泌表达。在本专利技术的一个实施方案中，所述方法还包括比较酵母胞内外源蛋白的量与分泌到上清中的外源蛋白的量的相对比例关系，从而选择表达克隆，表达并回收外源蛋白。专利技术人发现通过低温(20°C)下比较酵母胞内滞留的hIL-10与分泌到上清中hIL-10的量的相对比例关系，非常有效地避免了大量错误折叠的hIL-10蛋白在酵母胞内滞留而引起内质网压力，保证了甲醇诱导下hIL-10表达菌株处于最佳活力状态，同时有效地防止了真正的hIL-10高效表达克隆的落选。专利技术人发现低温下甲醇诱导hIL-10分泌表达可以显著提高上清中hIL-10的表达比例。在本专利技术的一个实施方案中，低温下甲醇诱导hIL-10分泌表达获得的上清蛋白/胞内蛋白的比例为1.3倍。在本专利技术的一个实施方案中，低温下甲醇诱导hIL-10分泌表达获得的上清蛋白/胞内蛋白的比例为至少2倍，优选为至少3倍，4倍，5倍，6倍，7倍，8倍，9倍，10倍等等。在本专利技术的优选实施方案中，低温下甲醇诱导hIL-10分泌表达获得的上清蛋白/胞内蛋白的比例为至少6倍。在本专利技术的一个实施方案中，所用的外源蛋白的编码序列是未经密码子优化的序列。在本专利技术的另一个实施方案中，所用的外源蛋白的编码序列是经密码子优化的序列。对编码序列进行优化以利于在宿主细胞中表达的方法是本领域技术人员熟知的。在本专利技术的方法中可以使用本领域技术人员熟知的各种合适的分泌信号肽，其包括但不限于α-因子、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、血清白蛋白分泌信号肽。在本专利技术的一个优选的实施方案中，所述分泌信号肽是α -因子分泌信号肽。本专利技术还一方面涉及在本专利技术所述的方法中构建的表达载体。本专利技术再一方面涉及包含本专利技术的表达载体的酵母菌株。本专利技术又一方面涉及本专利技术的表达载体和本专利技术的酵母菌株用于表达人白细胞介素-10的用途。本专利技术的技术方案示例性地说明如下。2.本专利技术的技术方案的示例性说明2.1)以pPICZca A载体为框架，再整合进毕赤酵母基因组中的rDNA-非编码区片段，构建出PUCZ9K载体。2.2)分别将α -交配因子-pre-pro序列与hIL_10编码序列的N端融合，同时在hIL-10的C端引入His-tag,并将融合好的蛋白编码序列插入pUCZ9K载体中，最后构建了以α -交配因子-pre-pro序列为分泌信号肽的hIL-10-His高效表达载体。再利用PUCZ9K载体中的rDNA-非编码区片段为整合位点，并通过逐步增加Zeocin的浓度(0.1mg/ml, 0.5mg/ml, 1.0mg/ml, 2.0mg/ml, 3.0mg/ml, 5.0mg/ml)来进行表达载体拷贝数的扩增，最终实现快速地获得含有不同拷贝数的单克隆的库。用Realtime PCR的方法鉴定单克隆库中的不同克隆的拷贝数。再用低温(20°本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于在酵母中表达外源蛋白的方法，其包括下述步骤：1)构建表达载体，所述表达载体包含rDNA非编码区，抗生素抗性基因，分泌信号肽和外源蛋白的编码序列；2)逐步增加抗生素的浓度，从而扩增所述表达载体的拷贝数，构建含有不同拷贝数的克隆的库；3)选择表达克隆，表达并回收外源蛋白。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：肖卫华，钟永军，田志刚，郭雨刚，李光伟，沈翼，张国英，
申请(专利权)人：中国科学技术大学，
类型：发明
国别省市：