快速感应损伤性刺激且高效表达的一种植物基因启动子制造技术

来源于水稻的一种基因启动子，具有快速感应外界损伤性刺激，并驱动其下游基因高效表达的特点；利用该启动子嵌合目的基因可以用于植物抗病、虫害的基因工程，也可用于植物逆境条件下的抗性基因工程。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种快速感应损伤性刺激且高效表达的植物基因启动子的DNA序列及其应用途径，属于植物基因工程领域。具体地说，经过损伤性诱导处理的水稻可以产生一种Bowman-Birk蛋白酶抑制剂基因的快速表达，利用该表达基因的序列可以从水稻中分离这种快速感应损伤性刺激且高效表达的水稻基因启动子的DNA序列，本专利技术还包括在该启动子的基础上可以衍生一系列具有启动子活性的DNA片段或组合，以及利用它们嵌合目的基因的抗虫、抗病或抗逆境伤害的抗性基因工程和分子育种途径。
技术介绍
水稻是世界上的最重要农作物之一。由于稻米具有高营养、可调理人体机能且多样化的特点，水稻已成为当今最受重视的禾谷类粮食。因此如何改进稻米的品质，提高水稻的抗病虫害能力，增加稻米产量等已经成为育种学家和植物病理学家研究的共同课题。水稻在生长过程中要经受多种病虫害的威胁我国1991年仅由于稻飞虱的大发生一项就造成稻谷损失约166万吨；此外以稻瘟病为代表的病害造成水稻减产可高达30％(Baker BP.，等，Science，1997，276736～728)。因此要使稻米达到高产和稳产就必须控制水稻病虫害。众所周知，植物定植后位置是固定的，表现出其一生“被动”的适应环境，且无法逃逸侵害的状况。为此长期以来植物排除病虫等有害因子的主要方式是依靠人力的帮助，如使用农药等。但是农药的使用能够造成非靶标生物因素的伤害，特别是有益生物的误伤，以及带来环境污染等不良的后果，因此人们更注重从生物本身寻找有效的方法和途径进行病虫害的防治。实际上，植物的“被动”只是表面现象，植物的长期进化过程中形成了类似动物逃逸的保护机制一防卫反应，只是不同植物之间，植物个体之间存在差异。作物育种就是根据其差异选择优良的品种或通过杂交集中优良性状于一身的选育方法。勿容置疑传统的抗病虫育种措施给作物高产稳产作出了一定贡献，而且在一段时期内仍将起着重要作用。但也日渐暴露出其脆弱的一面，如周期长，持效短且抗性多为垂直抗性，因而会造成选择压力，促进病原菌或害虫的加速进化和优势小种的出现。随着分子生物学的发展，分子育种为传统育种注入了新的活力，从1983年第一例转基因植物出现，现在通过转基因的分子育种正日趋成熟。实现植物广谱和持久抗病虫害一直是人们追求的理想目标利用分子育种手段，可以使这一目标的实现成为现实。孟山都公司将CaMV35s启动子驱动的Bt基因导入棉花，实现了棉花对棉铃虫等昆虫的有效控制。此外，抗病方面也有成功试验的报道，如用CaMV35s或其他组成型启动子驱动抗病或防卫基因表达对植物病原的有效控制(Anne Simon Moffat，Science，2001，2922270～2273)。但值得注意的是CaMV35s是组成型表达的启动子，在植物存活期内的长期表达不仅给致害生物因子可以造成强大的选择压力，而且对植物本身也可能造成生理影响(Aulbert SH.等，Annu.Rev.Phytopathol，2001，39285～312)。因此，理想的抗病策略应该是植物只有在受到病虫等因素危害时快速产生抗性物质或自身的保护物质从而使植物免受损害。Peng(Integrated ResourceManagement for Sustainable Agriculture，Ed.by Shi and Cheng.Beijing Agricultural University Press，1994，PP 450～453)设想利用诱导性表达基因的启动子嵌合抗性基因，转化植物从而达到广谱持效抗性的目的。很明显要实现这一设想，必须具备两个条件一是有可供选用的抗性基因，一是应该有侵害诱导性启动子。目前，有关抗性，防卫或信号传导等方面的基因报道较多，这为有效的进行抗病虫分子育种提供了丰富的目的基因材料，但侵害诱导性启动子，特别是能有效用于广谱抗病虫目的的且病虫侵害非特异诱导表达的启动子较少。本专利技术提供了一种从水稻中克隆的一段DNA序列，具有损伤性侵害的诱导表达的启动子活性一方面具有受稻瘟菌等病原菌的非特异侵害诱导表达的特点，因而可以用来抗病；另一方面由于具有伤害等损伤性刺激后的快速表达特点，而且依据害虫取食植物造成的损伤和其它伤害性损伤都是非特异性的特点(AndréKessler和Ian T.Baldwin，2002，Annu.Rev.Plant Biol.53299～328)，所以还可以用来作为抗害虫的启动子。
技术实现思路
本专利技术提供了一种快速感应损伤性刺激且高效表达的植物基因启动子，该启动子为从水稻中分离获得，具有稻瘟菌浸染诱导性的特点，属于水稻Bowman-Birk蛋白酶抑制剂基因的上游调控序列，为SEQ ID NO1所示的核苷酸序列；当该启动子或其衍生变体重新导入水稻中时能够感应损伤性刺激，并启动其下游嵌合基因的表达。该启动子或其衍生变体中，针对驱动报告基因GUS的表达活性，PIPA具有最强的表达特点。本专利技术同时提供了获得启动子衍生变体的途径和分析启动子活性区段的过程，通过启动子衍生变体驱动GUS表达活性的特点可以找到启动子的功能性区段。本专利技术还提供了广谱持久抗病虫的双元表达载体，利用该表达载体可以嵌合使用者感兴趣的目的基因用于抗病虫害。根据本专利技术的内容，目的在于提供广谱持久抗病虫害的育种途径，具体的说是利用本专利技术的广谱持久抗病虫的双元表达载体，用农杆菌介导法将嵌合基因导入植物中。以下内容将对本专利技术中的常用术语进行解释，并结合附图更详细说明实施方案本专利技术中的术语“分离”为从自然存在的水稻中通过某手段独立获取。本专利技术中的获取手段为首先通过差异显示PCR法(DDRT-PCR)找到稻瘟菌侵染诱导表达的条带，以差异条带为探针筛选水稻cDNA文库，对阳性克隆序列分析，最后以此为探针筛选水稻基因组文库，获取差异基因的上游DNA调控序列。本专利技术中的启动子区域或5′端调控序列指的是从转录起始位点 开始(记为1)其上游的部分。UTR部分为从A开始，延伸到下游翻译起始位点 之间的部分，这一部分序列的部分碱基或数目的非本质变化对启动子活性的改变不明显。这一部分序列为 TCACAAGCACCCACACCAACCAAAG 本专利技术中的启动子活性检测以报告基因GUS的表达为依据，通过构建启动子嵌合GUS的双元表达载体，并使之在水稻中的表达实现。本专利技术采用Jefferson等(EMBOJ.，1987，63901～3907)的方法，并稍加改进。本专利技术中的快速感应损伤性刺激且高效表达目的基因的双元载体，为在pCAMBIA301(Jefferson教授提供)的基础上改造得到的。“损伤性刺激”指造成水稻叶片破坏的影响方式(如本专利技术实施中的接种稻瘟菌后的破坏，刀痕损伤等)。“目的基因”为使用者将要选用的抗性方面的基因，可以是基因组中得到的DNA序列，也可以是cDNA序列，一切都根据使用者的目的意图而定。构建双元载体和选用目的基因都是分子生物学的常用的方法，可参考Maniatis等(分子克隆实验指南，第二版，冷泉港实验室，1990)或Sambrook等(分子克隆实验指南，1989)等文献的相关内容进行操作。本专利技术中启动子活性的验证是在水稻转化系统中进行的，所用方法为农杆菌介导的方法。当然也不排除其他方法如原生质体融合法、基因枪法本文档来自技高网...

【技术保护点】
来源于植物并从中分离的一ＤＮＡ片段，它属于一种水稻Ｂｏｗｍａｎ－Ｂｉｒｋ蛋白酶抑制剂基因的上游调控序列，具有受损伤性刺激后诱导表达的启动子活性，其最明显的特征是利用该调控序列嵌合目的基因再次导入植物后可以快速感应损伤性刺激信号，并驱动目的基因的高效表达，该启动子序列为ＳＥＱＩＤＮＯ：１的序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：彭友良，张世宏，范军，孙宗修，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]