本发明专利技术涉及用汉逊酵母表达系统产生HPV18?L1蛋白的方法。具体地，本发明专利技术公开了产生表达HPV18?L1蛋白的重组汉逊酵母细胞的方法以及由所述方法产生的重组汉逊酵母细胞。本发明专利技术还公开了利用所述重组汉逊酵母细胞产生HPV18?L1蛋白的方法以及所产生的HPV18?L1蛋白在制备预防性疫苗中的用途。
【技术实现步骤摘要】
用汉逊酵母表达系统产生HPV18 LI蛋白的方法专利
本专利技术属于医药生物工程
，涉及产生HPV18L1蛋白的方法，尤其涉及用汉逊酵母表达系统产生HPV18L1蛋白的方法。
技术介绍
人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)是一种无包膜的闭环双链DNA病毒，属乳多空病毒科多瘤病毒亚科，主要侵犯人体的上皮黏膜组织，进而诱发各种良性及恶性增生病变。目前已鉴定出来的不同亚型HPV超过200种，HPV感染具有明显的组织特异性，不同型别的HPV对于皮肤和黏膜的嗜向性不同，能诱发不同的乳头状病变，大约有30多种HPV型别与生殖道感染有关，其中有20多种与肿瘤相关。根据HPV诱发病变的良恶性不同，HPV可大致分为两类:1)高危型(如 HPV16、HPV18、HPV45、HPV31、HPV33、HPV52、HPV58、HPV35、HPV59、HPV56、HPV39、HPV51等):与人类多种组织恶性肿瘤密切相关，主要引起重度不典型增生和浸润癌，尤其以HPV16及HPV18型感染与宫颈癌的发生最为密切，这两个型别感染占宫颈癌感染的70%以上，其中HPV16占50%以上；2)低危型(如HPV6、HPV11、HPV40、HPV42、HPV43、HPV44、HPV54、HPV72、HPV 81等):可引起表皮细胞良性增殖性性病，如尖锐湿疣和扁平湿疣等，其中由HPV6与HPVll诱发的尖锐湿疣占90%以上。HPV主要由病毒外壳和基因组DNA构成。基因组长约7900bp，有8个病毒蛋白编码基因。其中6个ORF编码的蛋白在病毒复制的早期表达，称为早期蛋白；2个ORF编码的蛋白在病毒复制的晚期表达，称为晚期蛋白。晚期蛋白包括主要外壳蛋白LI及次要外壳蛋白L2,并参与病毒外壳的形成。HPV病毒外壳蛋白能够进行自组装，在多种表达系统中单独表达的LI蛋白或将LI蛋白与L2蛋白共表达时均能 自组装成病毒样颗粒(virus-like particle, VLP),其中以在酵母系统、杆状病毒昆虫表达系统及哺乳动物细胞表达系统等产生的VLP更接近天然病毒的结构。利用外源表达体系生产的VLP免疫后能够在体内诱发产生中和抗体，获得良好的免疫保护效果。多形汉逊酵母(Hansenula Polymorpha),又称作Pichia augusta,是当前公认的最为理想的外源基因表达系统之一。多形汉逊酵母作为单细胞真核微生物，既具备原核生物生长快速、易于遗传操作等特点，又有真核细胞翻译后加工和修饰等功能。此外，汉逊酵母还具备安全性好、易于培养、成本低廉、表达量高及遗传稳定等优势，并且能够克服诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株不稳定、产量低及糖基化侧链过长以及毕赤酵母(Pichia Pastoris)外源基因整合拷贝数较低的问题。目前，应用汉逊酵母表达系统生产的药物(如胰岛素，商品名Wosulin)及HBV疫苗(商品名Hepavax-Gene)均已上市销售。专利技术概述在第一个方面，本专利技术提供了一种产生表达HPV18L1蛋白的重组汉逊酵母细胞的方法，其包含以下步骤:a)通过将包含编码HPV18L1蛋白的核苷酸序列的外源多核苷酸插入载体来构建表达构建体；b)用步骤a)中获得的表达构建体转化汉逊酵母细胞；和c)对步骤b)中获得的汉逊酵母细胞进行筛选，获得含有所述外源多核苷酸的重组汉逊酵母细胞。在第二个方面，本专利技术还提供了根据上述方法产生的重组汉逊酵母细胞。在第三个方面，本专利技术还提供了一种产生HPV18L1蛋白的方法，包括以下步骤:i)在适于HPV18L1蛋白表达的条件下培养本专利技术的重组汉逊酵母细胞；和ii)从培养物中回收并纯化HPV18L1蛋白。在最后一个方面，本专利技术还提供了根据本专利技术的方法产生的HPV18L1蛋白在制备用于预防HPV18感染的疫苗中的用途。附图说明图1用于在汉逊酵母中表达外源蛋白的载体pRMHP2.1结构示意图。图2A以MOX启动子片段为探针的Southern印迹检测结果。以ATCC26012基因组DNA为对照。1:对照(上样量为:IOOOng) ；2:对照(上样量为:500ng) ；3:对照(上样量为:250ng) ；4:对照(上样量为:125ng) ；5:HP/pRMHP2.l_18wt基因组DNA(上样量为:7.8125ng，其亮度介于 500ng 和 IOOOng 对照之间)；6:HP/pRMHP2.l_18sc 基因组 DNA(上样量为-J.8125ng,其亮度介于500ng和IOOOng对照之间)；7:HP/pRMHP2.l_18pp基因组DNA(上样量为-J.8125ng，其亮度介于 250ng 和 500ng 对照之间)；8:HP/pRMHP2.l_18hp基因组DNA(上样量为:7.8125ng，其亮度介于250ng和500ng对照之间)；9:HP/PRMHP2.l-18hp-l基因组DNA (上样量为:62.5ng，其亮度介于500ng和IOOOng对照之间)。图2B以HPV 18L1的基因片段为探针的Southern印迹检测结果。1:HP/pRMHP2.l_18hp 基因组 DNA(上样量为:16ng) ；2:HP/pRMHP2.l_18hp 基因组 DNA(上样量为:8ng) ；3:HP/pRMHP2.l_18hp 基因组 DNA (上样量为:4ng) ；4:HP/pRMHP2.l_18hp 基因组DNA(上样量为:2ng) ；5:HP/pRMHP2.l_FMD18hp基因组DNA(上样量为:8ng，其亮度同8ng的 HP/pRMHP2.l-18hp 基因组 DNA) ；6:HP/pRMHP2.l_FMD18hp 基因组 DNA(上样量为:4ng，其亮度同4ng的HP/pRMHP2.l_18hp基因组DNA)。图3A HPV18L1蛋白在大肠杆菌中诱导表达的SDS-PAGE结果。1:未诱导的对照样品；2和3:IPTG诱导表达样品；4:蛋白标志物。图3B原核表达的HPV18L1蛋白的纯化结果。1:蛋白标志物；2:上柱样品；3:流穿液;4:洗脱HPV18L1蛋白。图3C兔多克隆抗体制备和纯化结果。1:抗血清；2:流穿液；3:洗脱抗体；4:蛋白标志物。图4不同的重组汉逊酵母细胞表达水平的Western印迹检测。1:HP/pRMHP2.l-18wt ；2:HP/pRMHP2.l_18sc ；3:HP/pRMHP2.l_18hp_l (针对汉逊酵母优化，外源基因整合拷贝数小于15) ；4:HP/pRMHP2.l_18pp ；5:HP/pRMHP2.l_18hp (针对汉逊酵母优化，整合拷贝数大于31) ；6:HP/pRMHP2.l_FMD18hp (针对汉逊酵母优化，整合拷贝数大于31，FMD启动子);7:标准品(30μ g/L) ；8:预染蛋白标志物。图5发酵过程中HPV18L1蛋白的表达检测。1:标准品(30 μ g/L) ；2:预染蛋白标志物；3:诱导前2小时；4:诱导O小时；5:诱导2小时；6:诱导4小时；7:诱导8小时；8:诱导10小时。图6A HPV18L1蛋白的POROS 50HS纯化电泳图。1:蛋白标志物；2:上柱样品；3:流穿液；4 7:不同N本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种产生表达人乳头瘤病毒18型L1(HPV18L1)蛋白的重组汉逊酵母细胞的方法，其包含以下步骤：a)通过将包含编码HPV18L1蛋白的核苷酸序列的外源多核苷酸插入载体来构建表达构建体；b)用步骤a)中获得的表达构建体转化汉逊酵母细胞；和c)对步骤b)中获得的汉逊酵母细胞进行筛选，获得含有所述外源多核苷酸的重组汉逊酵母细胞。
【技术特征摘要】
1.一种产生表达人乳头瘤病毒18型L1(HPV18L1)蛋白的重组汉逊酵母细胞的方法，其包含以下步骤: a)通过将包含编码HPV18L1蛋白的核苷酸序列的外源多核苷酸插入载体来构建表达构建体； b)用步骤a)中获得的表达构建体转化汉逊酵母细胞；和 c)对步骤b)中获得的汉逊酵母细胞进行筛选，获得含有所述外源多核苷酸的重组汉逊酵母细胞。2.权利要求1的方法，其中所述HPV18L1蛋白的氨基酸序列示于SEQID NO:1。3.权利要求2的方法，其中所述编码HPV18L1蛋白的核苷酸序列示于SEQID NO:5。4.权利要求1-3中任一项的方法，其中在所述表达构建体中所述外源多核苷酸可操纵地连接于启动子和终止子。5.权利要求4的方法，其中所述启动子是MOX启动子或FMD启动子。6.权利要求4或5的方法，其中所述终止子...
【专利技术属性】
技术研发人员：李鼎锋，于跃，霍烛，王贻杰，刘娟，程海，陈丹，刘勇，
申请(专利权)人：北京安百胜生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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