同时检测引起苹果牛眼果腐病的4种病原菌的实时荧光PCR引物探针组合及方法技术

本发明专利技术提供一种用于同时检测引起苹果牛眼果腐病的4种病原菌的实时荧光PCR引物探针组合，所述引物探针组合的序列分别如SEQ ID No.1-6所示。本发明专利技术还基于所述引物探针组合建立了同时检测引起苹果牛眼果腐病的4种病原菌的实时荧光PCR方法，可实现对引起苹果牛眼果腐病的4种病原菌的检测。本发明专利技术的实时荧光PCR引物探针组合及检测方法特异性好、通量高、快速，提高了检测效率，为引起苹果牛眼果腐病的4种病原菌的检测提供了更有效的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术设及分子生物学检测技术，具体地说，设及一种同时检测引起苹果牛眼果 腐病的4种病原菌的实时巧光PCR引物探针组合及方法。
技术介绍
苹果牛眼果腐病度uirs-eyerotofapple)是我国关注的进境水果真菌病害， 病原菌包括Neofabraeamalicorticis、N.perennans、N.a化a和N.kienholzii运 4 个种， 其中N.malicodicis(异名：Peziculamalicodicis)被列入我国进境植物检疫性有害生 物名录中。苹果牛眼果腐病是苹果和梨重要的采后病害，难W防控，不仅为害果实，导致严 重的采后损失，而且可侵害枝条、树干，导致树势衰弱、幼树死亡。其在世界范围内广泛分 布，但尚未在我国发现。该病一旦传入我国，在我国苹果产区扩散、定殖的可能性很大，将对 我国苹果生产造成严重威胁，十分必要加大口岸检疫力度，严防该病菌的传入。然而，苹果 牛眼果腐病菌相似的形态特征和生理特性使运些病原菌的区分非常困难，要求鉴定者必须 具备丰富的真菌分类学基础与经验。加之传统检验方法周期长，不符合进境水果快速通关 的要求，使其成为进境水果真菌病害检疫的瓶颈。因此建立快速准确的检测体系尤为必要。 近年随着分子生物学技术的迅速发展，大量WPCR为基础的技术广泛地运用到植 物病原菌的鉴定中，大大提高了鉴定的速度和准确性。实时巧光PCR结合了巧光检测系统 和PCR扩增系统，通过巧光放大检测信号，在PCR扩增的过程中就能检测模板DNA的扩增， 不需要凝胶电泳分析，简化了检测程序，与常规的PCR比较更能缩短检测周期。而且其检测 特异性强，灵敏度高，其运用范围越来越广泛。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对W上要解决的技术问题，提供一种特异性好、灵敏度高的同 时检测引起苹果牛眼果腐病的4种病原菌的实时巧光PCR引物探针组合。 本专利技术的另一个目的是提供一种用于实时巧光PCR检测引起苹果牛眼果腐病的4 种病原菌的试剂盒。 本专利技术的再一个目的是提供同时检测引起苹果牛眼果腐病的4种病原菌的实时 巧光PCR方法。 为了实现本专利技术目的，本专利技术提供了一种同时检测引起苹果牛眼果腐病的4种病 原菌的实时巧光PCR引物探针组合，该引物探针组合包括W下引物： NeoF:5' -CCCTCGGTGGGGCAAAG-3'; NeoR:5' -CCAACTCGGCGGCTTCC-3f; MAL-P：FAM-TCATCATCATTTTCATCATC-MGB； 阳R-P:CY5-CGCGTATCGCAACATCATCATTTTCATCAT-B册2 ; ALB-P:肥D-AAGATGTTCAACCCCTCCCTCGCGTA-B册 1 ; KIE-P :肥X-TGACCACTTGATGATCTC-MGB ; 其中，FAM、CY5、肥D、肥X为巧光基团，MGB、B册1、B册2为巧灭基团。 上述引物中，Neo F和化0R为检测苹果牛眼果腐病的4种病原菌的通用引物； MAkPa为检测N. malico;rticis的特异性探针；PER-Pb为检测N. perennans的特异性探针； ALB-Pc为检测N. a化a的特异性探针；KIE-Pd为检测N. kienholzii的特异性探针。 本专利技术还提供了用于实时巧光PCR检测引起苹果牛眼果腐病的4种病原菌的试剂 盒，该试剂盒含有上述引物探针组合。 优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2\PCR反应缓冲液中的至少 一种。 更优选地，所述试剂盒还包括阳性对照。 本专利技术进一步提供了一种同时检测引起苹果牛眼果腐病的4种病原菌的实时巧 光PCR方法，即利用所述引物探针组合进行实时巧光PCR检测待测样品。 具体地，所述方法包括W下步骤：1)提取待检测样品中的DNA;2)W步骤1)中提 取的DNA为模板，进行实时巧光PCR扩增反应；3)分析Ct值。[002。 其中，实时巧光PCR反应体系W20μL计为：[002引模板DNA 50ng， 引物 每条引物的终浓度均为〇.5μπιο1/1， 探针 每条探针的终浓度均为0. 25 μ mol/l，2XThunderbird Probe qPCR Mix 10 μL, (1地2〇补足至20 μ L ;其中，2XThunderbirdProbeqPCRMix内含DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲 液、ROX。2X化underbirdProbeqPCRMix购自东洋纺（上海）生物科技有限公司，货号 为WS-101。 其中，实时巧光PCR反应条件为：95°C10分钟；94°C15秒，60°C60秒，共40个循 环，每个循环结束后在FAM、CY5、肥D、肥X通道下检测巧光信号。 上述方法中，步骤3)中根据FAM、CY5、肥D、肥X通道下的巧光信号Ct值进行结果 判断。若FAM通道下Ct值小于35,贝Ij判为N.malicodicis阳性，若Ct值大于35或无扩增 信号则判为N.malico;rticis阴性；若CY5通道下Ct值小于35,卯J判为N.perennans阳性， 若Ct值大于35或无扩增信号则判为N.perennans阴性；若肥D通道下Ct值小于35,卯J判 为N.a化a阳性，若Ct值大于35或无扩增信号则判为N.a化a阴性；若肥X通道下Ct值小 于35,卯J判为N.kienholzii阳性，若Ct值大于35或无扩增信号则判为N.kienholzii阴 性； 本专利技术根据4种苹果牛眼果腐病菌的EF-la基因特异序列，设计了 1对通用引物 和4条特异性探针，并基于运些引物探针组合建立了同时检测引起苹果牛眼果腐病的4种 病原菌的实时巧光PCR方法，可实现对样品的定性检测。 实验表明，本专利技术的引物探针组合、试剂盒及检测方法特异性好、灵敏度高、通量 高、快速，提高了检测效率，为引起苹果牛眼果腐病的4种病原菌的检测提供了更有效的方 法。【附图说明】图1为本专利技术在FAM通道下的特异性实验结果，其中从左至右1-2分别为菌株CBS 102863、CBS102872。图2为本专利技术在CY5通道下的特异性实验结果，其中从左至右1-6分别为菌株CBS 139. 4UCBS102869、CBS102873、CBS453. 64、VPRI41734、VPRI10502。图3为本专利技术在肥D通道下的特异性实验结果，其中从左至右1-6分别为菌株CBS 109875、CBS102871、CBS628. 72、CBS452. 64、CBS304. 62、CBS261.32。 图4为本专利技术在肥X通道下的特异性实验结果，其中1为菌株CBS355. 72。 图5为本专利技术在FAM通道下的灵敏度实验结果，其中1-6分别为浓度10化g/μ^ lOng/μLIng/μLO.Ing/μLO.Olng/μL和 0.OOlng/μL。 图6为本专利技术在CY5通道下的灵敏度实验结果，其中1-5分别为浓度l(K)ng/μL lOng/μL Ing/μLO. Ing/μL和 0.Olng/μL。 图7为本专利技术在肥D通道下的灵敏度实验结果，其中1-6分别为浓度10化g/μL lOng/μLIng/μLO.Ing/μLO.Olng/μL和 0.OOlng/μL。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种同时检测引起苹果牛眼果腐病的4种病原菌的实时荧光PCR引物探针组合，该引物探针组合包括以下引物：Neo F：5′‑CCCTCGGTGGGGCAAAG‑3′；Neo R：5′‑CCAACTCGGCGGCTTCC‑3′；MAL‑P：FAM‑TCATCATCATTTTCATCATC‑MGB；PER‑P：CY5‑CGCGTATCGCAACATCATCATTTTCATCAT‑BHQ2；ALB‑P：NED‑AAGATGTTCAACCCCTCCCTCGCGTA‑BHQ1；KIE‑P：HEX‑TGACCACTTGATGATCTC‑MGB；其中，FAM、CY5、NED、HEX为荧光基团，MGB、BHQ1、BHQ2为猝灭基团。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王卫芳，林惠娇，胡学难，何日荣，
申请(专利权)人：广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，中华人民共和国黄埔出入境检验检疫局，
类型：发明
国别省市：广东;44