本发明专利技术提供了一种与抵御病虫害侵袭相关的茉莉酸诱导蛋白、编码该蛋白的基因和含有该基因的植物表达载体。本发明专利技术还提供了利用本发明专利技术的基因培育抗病虫害的转基因植株的方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及与小麦抵御病虫害侵袭相关的茉莉酸诱导蛋白、编码该蛋白的基因和含有该基因的表达载体，本专利技术还涉及一种使用编码茉莉酸诱导蛋白的基因培育抗病虫害的转基因植株的方法。
技术介绍
茉莉酸类物质是环戊酮类的衍生物，通过亚麻酸合成(Sembdner和Parthier，1993，Annu.Rev.Plant Physiol 54328-332.1)。其主要的生理活性物质为茉莉酸(JA)及其甲酯(JM)。这两种化合物广泛存在于各种植物组织中，在快速生长的组织中含量比较高，如茎尖，根尖，未成熟的果实和幼叶等。最早证明茉莉酸具有信号传导作用是通过研究茉莉酸促进叶片的衰老(Mueller-Uri等，1988，Planta，176241-247)。现在大量的证据表明茉莉酸在联系外界环境变化和细胞内代谢变化的信号传导过程中起重要作用，是一类新型的植物生长调节物质，特别是在植物的受伤反应和抵御病虫害的防御反应中发挥重要作用(Creelman，和Mullet，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，924114-41191)。在番茄中如果缺乏茉莉酸合成(茉莉酸合成缺失突变体)，将天蛾幼虫在这种植物上放养时，幼虫的生长量会增加四倍，反之在植物上喷洒茉莉酸不仅能降低有害毛虫的生长，而且还使寄生性黄蜂对毛虫的捕食增加两倍(Thaler，1999，Nature，399686-688)。茉莉酸作为一类植物生长调节物质，其作用主要是将各种信号传递到植物细胞中，并引起基因表达的改变，合成新的蛋白质和酶，从而发挥各种生理功能(Wasternack和Parthier，1997，Trends Plant Sci.，2302-307)。因此研究受茉莉酸诱导的基因，阐明其编码的蛋白质，以及其生物学作用，对于了解茉莉酸的作用，更好的利用茉莉酸调节植物对病虫害的防御反应，具有非常重要的意义。在植物中已经确定受茉莉酸诱导而新合成的蛋白质包括蛋白酶抑制剂、病理相关蛋白、植保素合成酶，细胞壁蛋白、渗调素、脂肪氧化酶等，这些蛋白质和酶在植物抵御病虫害侵袭中也发挥着重要作用。对于禾本科中重要的粮食作物中有关茉莉酸诱导蛋白的研究还很少。至今，在国内外尚未见有关在小麦中发现与抵御病虫害侵袭相关的茉莉酸诱导蛋白基因研究的报道。无论在中国还是在世界范围内，小麦都是最重要的农作物之一。它也是适应性最广的作物，其产量在包括玉米、水稻和马铃薯在内的重要农作物中位居第一。但是小麦的病虫害可以对产量造成严重的损失，如小麦吸浆虫，在严重发生的田块产量损失在80％以上，因此对农业生产造成的损失十分巨大。利用化学药剂进行病虫害的防治工作，虽然能取得很大的成效，但是却会造成环境的污染和生态平衡的破坏。利用小麦的抵御病虫害侵袭相关的茉莉酸诱导蛋白基因，通过基因工程手段，调节基因的表达活性，从而增加小麦抵御病虫害的能力，对于获得抗病虫害的小麦新品种有着十分重要的意义，因而在植物基因工程
中具有广泛的应用潜力。
技术实现思路
本专利技术通过提供一种在小麦中与抵御病虫害侵袭相关的茉莉酸诱导蛋白基因，和由其编码的蛋白质，达到调节小麦的防御反应，增强小麦抵御病虫害侵袭的目的。本专利技术的另一个目的是提供可将上述基因翻译成完整蛋白质的表达质粒。本专利技术的一个目的是提供一种小麦中与抵御病虫害侵袭相关的茉莉酸诱导蛋白。本专利技术的另一个目的是提供一种编码小麦中与抵御病虫害侵袭相关的茉莉酸诱导蛋白的基因。本专利技术的再一个目的是提供一种含有本专利技术的基因并将基因翻译成活性蛋白质的表达质粒，以及可以转化植物细胞的植物表达载体。本专利技术提供了一种编码小麦中与抵御病虫害侵袭相关的茉莉酸诱导蛋白基因的DNA序列，它选自下组(1).编码SEQ ID NO2的氨基酸序列的DNA序列或(2).与(1)的序列能够杂交，并能够编码小麦中与抵御病虫害侵袭相关的茉莉酸诱导蛋白的DNA序列。所述的杂交条件是指，将杂交膜置于预杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH 7.2，7％SDS)中，65℃预杂交30min；弃预杂交液，加入杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，7％SDS，同位素标记的核苷酸片段)，65℃杂交12hr；弃杂交液，加入洗膜液I(20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，5％SDS)，65℃洗膜2次，每次30min；加入洗膜液II(20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，1％SDS)，65℃洗膜2次，每次30min。本专利技术的DNA序列为编码小麦中一种与抵御病虫害侵袭相关的茉莉酸诱导蛋白基因(Ta-JA1)的全长cDNA，命名为Ta-JA1。该序列共由1158个碱基组成，其中，5’端未翻译区包括57个碱基，3’端未翻译区包括186个碱基(其中包括17个碱基组成的PolyA)，编码区由915个碱基组成，如图SEQ ID NO1所示的序列，该序列中A占27.43％(251个)，C占23.50％(215个)，G占25.36％(232个)，T占23.72％(217个)，A+T占51.15％(468个)，C+G占48.85％(447个)。在国际基因序列数据库(GenBank\EMBL\DDBJ)中的基因同源性分析表明，Ta-JA1基因是小麦中未曾报道的新基因，它与从大麦(Hordeum vulgare L.)中分离出的一个未鉴定基因具有同源性。本专利技术还提供了一种由上述的DNA序列编码的氨基酸序列。这种氨基酸序列优选具有SEQ ID NO2所示的序列。该蛋白质序列包括304个氨基酸，如SEQ ID NO2所示。在该蛋白质序列中，疏水氨基酸占104个，亲水氨基酸占90个，碱性氨基酸占25个，酸性氨基酸占22个，该蛋白质的分子量为32.7KD，等电点为8.7。该蛋白质是国际上未曾报道的新蛋白质。本专利技术还提供了一种含有上述DNA序列的表达载体，以及另外一种植物表达载体。它可以是含有上述的DNA序列的表达载体pET-29b(Novagen，USA)，或者用于植物细胞转化的含有actin启动子和Bar选择基因标记的载体pTa-JA1(来源于pBluescriptSK，Stratagene Co，USA)。这两种表达载体的构建过程如下在Ta-JA1基因编码区两侧合成引物，并分别引入HindIII及NotI酶切位点，其引物序列分别为 5’-引物5’-CACAAGCTTATGGCCAATTTCCAGATAAC-3’，3’-引物5’-AATTGAATGCGGCCGCTTAGAGAGGGTGCACGTAG-3’。经过PCR扩增出Ta-JA1基因的全长编码区，以HindIII与NotI双酶切下，连接到表达载体pET-29b的相应酶切位点上(见图1)，通过酶切和序列分析证明此表达载体的完整性和正确性。将表达载体转化大肠杆菌BL21菌株，经过IPTG诱导后，将大肠杆菌蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳分析，并将蛋白质经过电转移转到硝酸纤维素膜上，利用S-Tag特异性抗体进行免疫检测，证明Ta-JA1基因已在大肠杆菌中翻译出正确的蛋白质。经过PCR扩增出Ta-JA1基因的全长编码区，以HindIII与NotI双酶切下，连接到含有Actin启动子和Bar选择基因标记的载体(见图2)，通过酶切分析证明此表达载体的完整性和正确本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种编码小麦中与抵御病虫害侵袭相关的茉莉酸诱导蛋白的ＤＮＡ序列，其特征在于具有：（１）编码ＳＥＱＩＤＮＯ：２的氨基酸序列的ＤＮＡ序列或（２）与（１）的ＤＮＡ序列能够杂交，并能够编码完整的茉莉酸诱导蛋白的ＤＮＡ序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：马庆虎，田斌，
申请(专利权)人：中国科学院植物研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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