本发明专利技术提出一种与苹果抗炭疽菌叶枯病基因位点紧密连锁的分子标记及其应用，分子标记包括6个SNP标记以及5个InDel标记，分别为SNP3955，SNP4236，SNP4257，SNP4299，SNP4336，SNP4432，InDel4199，InDel4227，InDel4254，InDel4305及InDel4334。此外，本发明专利技术还提出筛选该标记的方法，以及上述标记的应用。本发明专利技术利用全基因组重测序技术开发出的SNP及InDel标记，结合Rgls基因初步定位结果（位于SSR标记S0304673和S0405127之间），选出在Rgls基因两侧的的SNP和InDel标记，通过HRM曲线分析技术对18个SNP位点和30个InDel位点进行了分析，筛选出6个SNP 及5个InDel标记与Rgls基因位点紧密连锁。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于苹果育种
，具体涉及一种与苹果抗炭疽菌叶枯病基因位点紧密连锁的分子标记及应用。
技术介绍
苹果炭疽菌叶枯病(GlomerellaLeafSpot，GLS)是一种流行性很强的真菌病害，短时间内即可造成大量叶片干枯脱落，严重时造成二次开花，也侵染果实引起坏死性斑点(Leiteetal.1988；González&Sutton,1999；González,2003；wangetal.2012；宋清等2012)。对该病进行有效药物防治较为困难。培育抗病品种是解决该问题的有效途径。由于苹果杂种树有较长的童期，导致传统育种周期很长。因此利用DNA分子标记进行早期选择对提高筛选效率和育种效率有着极其重要的意义。先前的研究结果表明，苹果对炭疽菌叶枯病的抗性是由隐性单基因控制的(Dantasetal.2009；刘源霞等，2015)。本课题组利用11个SSR标记构建了苹果抗炭疽菌叶枯病基因位点的遗传连锁图谱，将其定位于苹果第15条染色体上，位于标记SSR0304673和SSR0405127之间，遗传距离为1.3cM，物理距离为500kb。大量存在于基因组DNA序列的SNP和InDel标记，已被广泛应用于图位克隆、基因定位、动植物遗传多样性的鉴定、分子标记辅助育种等领域(Janderetal.2002；Schnabeletal.2005；王岩等,2009；王明军等，2010)。随着高通量测序技术的快速发展，利用全基因组重测序(wholegenomere-sequencing,WGR)技术结合混合分组分析法(bulkedsegregantanalysis,BSA)可高效检测出通过双亲杂交建立的后代群体中导致表型变异的QTL和突变位点(Abeetal.2012；Takagietal.2013)，并且可以识别大量的SNP和InDel位点,从而进行SNP及InDel标记的开发，获得基因区SNP及InDel标记，为后续遗传图谱的构建及基因定位奠定基础。分子标记辅助选择育种(markerassistedselection，MAS)作为一种高效的现代分子育种技术，已被广泛应用于作物遗传改良和品种选育。它是利用与目标基因紧密连锁的分子标记，来鉴定不同个体的基因型，从而进行辅助选择育种。与通过表现型间接对基因型进行选择的传统育种方法相比，MAS育种能有效结合基因型与表型鉴定结果，避免选育过程中的盲目性和不可预测性，从而显著提高选择的准确性和育种效率。
技术实现思路
本专利技术的目的是利用全基因组重测序技术与BSA分析相结合的方法获得的SNP及InDel位点，开发SNP及InDel引物，并通过HRM技术进行筛选与苹果抗炭疽菌叶枯病基因位点紧密连锁的SNP和InDel标记，进一步缩小抗病基因位点的区域范围，为基因克隆提供有价值的遗传信息。技术方案如下：首先本专利技术提出一种与苹果抗炭疽菌叶枯病基因位点紧密连锁的分子标记，包括6个SNP标记以及5个InDel标记，分别为SNP3955，SNP4236，SNP4257，SNP4299，SNP4336，SNP4432，InDel4199，InDel4227，InDel4254，InDel4305及InDel4334；用于扩增上述标记的引物分别为：SNP3955-R和SNP3955-F核苷酸序列分别如SEQIDNo.1、2所示；SNP4236-R和SNP4236-F核苷酸序列分别如SEQIDNo.3、4所示；SNP4257-R和SNP4257-F核苷酸序列分别如SEQIDNo.5、6所示；SNP4299-R和SNP4299-F核苷酸序列分别如SEQIDNo.7、8所示；SNP4336-R和SNP4336-F核苷酸序列分别如SEQIDNo.9、10所示；SNP4432-R和SNP4432-F核苷酸序列分别如SEQIDNo.11、12所示；InDel4199-R和InDel4199-F核苷酸序列分别如SEQIDNo.13、14所示；InDel4227-R和InDel4227-F核苷酸序列分别如SEQIDNo.15、16所示；InDel4254-R和InDel4254-F核苷酸序列分别如SEQIDNo.17、18所示；InDel4305-R和InDel4305-F核苷酸序列分别如SEQIDNo.19、20所示；InDel4334-R和InDel4334-F核苷酸序列分别如SEQIDNo.21、22所示。优选的，所述SNP标记SNP4236，InDel标记InDel4227以及InDel4254与Rgls基因位点共分离。优选的，SNP标记SNP4236，InDel标记InDel4254和InDel4227可应用于田间栽培品种、品系、种质资源以及杂种后代幼苗对炭疽菌叶枯病抗性的鉴定。优选的，SNP标记SNP4236和InDel标记InDel4254鉴定抗病感病的准确率分别为98.0％，96.0％。本专利技术还提出一种与苹果抗炭疽菌叶枯病基因位点紧密连锁的分子标记的筛选方法，包括如下步骤：S1，通过全基因组重测序以及结合Rgls基因初步定位结果，筛选出位于Rgls基因两侧的SNP和InDel标记位点，并设计出SNP引物和InDel引物；S2，利用BSA法及HRM技术分析对设计的引物进行筛选验证，从而筛选出与Rgls基因位点连锁的6个SNP标记及5个InDel标记，即权利要求1中所述的SNP标记SNP3955，SNP4236，SNP4257，SNP4299，SNP4336和SNP4432以及InDel标记InDel4199，InDel4227，InDel4254，InDel4305和InDel4334。此外，本专利技术还提出利用分子标记精细定位Rgls基因位点的方法，包括如下步骤：S1，通过全基因组重测序以及结合Rgls基因初步定位结果，筛选出位于Rgls基因两侧的SNP和InDel标记位点，并设计出SNP引物和InDel引物；S2，利用BSA法及HRM技术分析对设计的引物进行筛选验证，从而筛选出与Rgls基因位点连锁的6个SNP标记及5个InDel标记，即权利要求1中所述的SNP标记SNP3955，SNP4236，SNP4257，SNP4299，SNP4336和SNP4432以及InDel标记InDel4199，InDel4227，InDel4254，InDel4305和InDel4334。S3，利用SNP标记SNP3955，SNP4236，SNP4257，SNP4299，SNP4336和SNP4432，以及InDel标记InDel4199，InDel4227，InDel4254，InDel4334对重组个体的基因型和抗病表型进行分析，将基因Rgls位点定位于InDel4199和SNP4257之间，物理距离为58kb。此外，本专利技术还提出一种上述分子标记在苹果抗炭疽菌叶枯病分子育种的应用。本专利技术相对于现有技术所具有的优点为：1.首先，本专利技术利用全基因组重测序技术开发出的SNP及InDel标记，结合Rgls基因初步定位结果，选出在Rgls基因两侧的SNP和InDel标记，通过HRM曲线分析技术对18个SNP位点和30个InDel位点进行了分析，筛选出6个SNP及5个InDel标记与Rgls基因位点紧本文档来自技高网...
【技术保护点】
与苹果抗炭疽菌叶枯病基因位点紧密连锁的分子标记，其特征在于，包括6个SNP标记以及5个InDel标记，分别为SNP3955，SNP4236，SNP4257，SNP4299，SNP4336，SNP4432，InDel4199，InDel4227，InDel4254，InDel4305及InDel4334；用于扩增上述标记的引物分别为：SNP3955‑R和SNP3955‑F核苷酸序列分别如SEQ ID No. 1、2所示； SNP4236‑R和SNP4236‑F核苷酸序列分别如SEQ ID No. 3、4所示；SNP4257‑R和SNP4257‑F核苷酸序列分别如SEQ ID No. 5、6所示；SNP4299‑R和SNP4299‑F核苷酸序列分别如SEQ ID No. 7、8所示；SNP4336‑R和SNP4336‑F核苷酸序列分别如SEQ ID No. 9、10所示；SNP4432‑R和SNP4432‑F核苷酸序列分别如SEQ ID No.11、12所示；InDel4199‑R和InDel4199‑F核苷酸序列分别如SEQ ID No.13、14所示；InDel4227‑R和InDel4227‑F核苷酸序列分别如SEQ ID No.15、16所示； InDel4254‑R和InDel4254‑F核苷酸序列分别如SEQ ID No.17、18所示；InDel4305‑R和InDel4305‑F核苷酸序列分别如SEQ ID No.19、20所示；InDel4334‑R和InDel4334‑F核苷酸序列分别如SEQ ID No.21、22所示。...
【技术特征摘要】
1.与苹果抗炭疽菌叶枯病基因位点紧密连锁的分子标记，其特征在于，包括6个SNP标记以及5个InDel标记，分别为SNP3955，SNP4236，SNP4257，SNP4299，SNP4336，SNP4432，InDel4199，InDel4227，InDel4254，InDel4305及InDel4334；用于扩增上述标记的引物分别为：SNP3955-R和SNP3955-F核苷酸序列分别如SEQIDNo.1、2所示；SNP4236-R和SNP4236-F核苷酸序列分别如SEQIDNo.3、4所示；SNP4257-R和SNP4257-F核苷酸序列分别如SEQIDNo.5、6所示；SNP4299-R和SNP4299-F核苷酸序列分别如SEQIDNo.7、8所示；SNP4336-R和SNP4336-F核苷酸序列分别如SEQIDNo.9、10所示；SNP4432-R和SNP4432-F核苷酸序列分别如SEQIDNo.11、12所示；InDel4199-R和InDel4199-F核苷酸序列分别如SEQIDNo.13、14所示；InDel4227-R和InDel4227-F核苷酸序列分别如SEQIDNo.15、16所示；InDel4254-R和InDel4254-F核苷酸序列分别如SEQIDNo.17、18所示；InDel4305-R和InDel4305-F核苷酸序列分别如SEQIDNo.19、20所示；InDel4334-R和InDel4334-F核苷酸序列分别如SEQIDNo.21、22所示。2.根据权利要求1所述的与苹果抗炭疽菌叶枯病基因位点紧密连锁的分子标记，其特征在于，所述SNP标记SNP4236，InDel标记InDel4227以及InDel4254与Rgls基因位点共分离。3.根据权利要求2所述的与苹果抗炭疽菌叶枯病基因位点紧密连锁的分子标记，其特征在于，SNP标记SNP4236，InDel标记InDel4254和InDel4227可应用于田间栽培品种、品系、种质资源以及杂种后代幼苗对炭疽菌叶枯病抗性的鉴定。4.根据权利要求3所述的与苹果抗炭疽菌...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘源霞，兰进好，戴洪义，张玉刚，祝军，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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