本发明专利技术涉及广亲和基因Ｓ↓［５］↑［ｎ］的分子标记方法，属于分子遗传学领域。根据已克隆的广亲和基因Ｓ↓［５］↑［ｎ］和籼稻等位基因Ｓｉ、粳稻等位基因Ｓｊ基因结构的差异设计了ＩｎＤｅｌ标记Ｓ５１３６，该ＩｎＤｅｌ标记与广亲和基因Ｓ↓［５］↑［ｎ］及其等位基因共分离。利用该标记可以准确地从品种资源中筛选鉴别带有广亲和基因Ｓ↓［５］↑［ｎ］的材料，可用于广亲和基因Ｓ↓［５］↑［ｎ］的分子标记育种和水稻广亲和恢复系的选育。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术提供了广亲和基因&"的分子标记鉴定方法，属于分子遗传学领域，专用于广亲和基因s/的基因型鉴定。
技术介绍
栽培稻(Oy加w "vfl[ L.)分为籼稻(Oyza sariva L. indica sub)和粳稻(Oyza ^"va( L. japonicasub)两个亚种，亚种间杂种具有很强的优势。但籼粳亚种间杂种存在育性障碍， 结实率很低，限制了杂种优势的利用。在水稻中存在一类特殊的种质资源称为广亲和 品种，如江苏农业科学院选育的02428，与多数的籼稻和粳稻杂交的后代都表现正常可 育，其广亲和基因已经成功克隆。正常的S5基因编码一个天冬氨酰蛋白酶，通过控制 雌配子的育性而影响结实率。籼粳稻的S5等位基因间仅两个碱基的差别，引起相应蛋 白质两个氨基酸的替换，可能是造成其杂种不育的原因。广亲和品种的&"基因则因其 大片段缺失，导致功能丧失，无论与籼稻还是粳稻杂交都不影响杂种育性。栽培稻的籼粳不育和广亲和性的并存在生物进化中是一种很奇特的现象籼粳分 化造就了丰富多样的稻种资源，也导致生殖隔离，而广亲和基因的存在则给籼粳亚种 间基因交流提供桥梁。利用广亲和基因的有关信息，可直接用于发掘其他广亲和基因， 等位基因差异可作为分子标记应用于广亲和品种的培育。有效地应用广亲和基因能够 克服水稻籼粳亚种间杂种的不育性，从而利用籼粳亚种间强大的杂种优势，提髙水稻 的产量。
技术实现思路
本专利技术的目的是开发广亲和基因的功能标记，利用本研究开发的基于PCR 的实用经济型标记，可以有效地对广亲和基因&"进行基因型选择，既可以用于水稻资 源的筛选鉴定，又可以用于广亲和基因S/的分子育种。本专利技术所提供的可广亲和基因&"进行基因型选择的InDel标记S5136，是通过以 下方法获得的1) 利用广亲和粳稻品种02428与籼稻3037构建F2分离群体。2) 广亲和基因&"已经克隆((PNAS，2008， 105(32): 11436-11431 ))。 S5基因编码一个天冬氨酰蛋白酶，通过控制雌配子的育性而影响结实率。籼粳稻的S5等位基因间 仅两个碱基的差别，引起相应蛋白质两个氨基酸的替换，造成其杂种的不育。广亲和 品种的&"基因(广亲和基因)在5'端缺失136bp,导致基因功能丧失，无论与籼稻 还是粳稻杂交都不影响杂种育性。我们根据这136bp缺失设计了 InDel标记， InDel标记S5136引物序列如下 上游引物5' ATCAACCCATTTCCTTTCCT 3' 下游引物5' ATACGCTCGATCGGATTAAC 3' 对广亲和材料扩增出441bp,对普通籼稻和粳稻扩增出577bp。 3 )利用SDS方法提取02428与3037的F2群体各单株的DNA,利用InDel标记 S5136引物进行PCR,扩增产物在1%的琼脂糖电泳分析，我们发现该标记与等位基因 共分离。即该标记是共显性标记，能对广亲和基因和非广亲和基因的纯合基因型和杂 合基因型进行准确鉴定，标记基因型符合l: 2: l的比例(图l)。4)利用该标记对太湖流域粳稻资源和东南亚一带的品种资源进行了广亲和基因资 源筛选，发现了 17份带有广亲和基因的材料。本研究所提供的分子标记方法，具有如下优点 通过本专利技术获得了广亲和基因"进行基因型鉴别的共显性分子标记。 本专利技术的分子标记可以从直观地从品种资源材料中筛选广亲和基因可用于广 亲和基因的分子标记选择育种，由于可以进行基因型选择，可以省去繁杂的亲和性鉴 定过程，极大地缩短育种进程，提高育种效率。附图说明图1引物S5136对"3037/02428"F2群体PCR扩增产物在1%的琼脂糖胶电泳结果； (Pl为02428， P2为3037, F!为杂种，1-19为F2群体的部分单株)图2引物S5136对部份材料PCR扩增产物在1%的琼脂糖胶电泳结果，具有广亲 和基因&"的Dular、水源341带型一致，而其余材料带型一致；(M为DNA ladder; a 为100bp; b为250bp; c为500bp; d为750bp; e为lkb;f为2kb; l-23:部分品种资源材 料)下面实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例l、 一种鉴别广亲和基因&"基因型分子标记的获得 1供试材料江苏农学院选育的籼稻3037与粳型广亲和品种02428的杂种F>以及Fa群体。 2 DNA提取在水稻分蘖期或孕穗期取1克左右水稻叶片，利用SDS方法提取DNA。 DNA提取参照Dellapporta等(1983 )的方法，略有修改，具体步骤如下① 取200-300 mg新鲜水稻叶片(-20°C保存的叶片)，在-20°C预冷研钵中用液氮研磨 成粉末。② 转移到1.5 ml离心管中。③ 加入600ul SDS提取液摇匀，65°C,温浴30min,振荡3-4次。加入1/4体积(约100ul)KAc，摇匀。⑤ 加入1/2体积(约300-400 ul)的氯仿:异戊醇(体积比:24: 1),振荡器上充分摇匀 (120rpm， 30min)。⑥ 室温下6000-8000rpm离心15min，取上清。⑦ 加入2倍体积(700ul左右)-2(TC预冷的无水乙醇、摇匀，-20'C自由沉淀20min。⑧ 室温下12000rpm离心6min，弃上清，沉淀用等体积(400 ul左右)70%乙醇洗涤 10min。⑨ 弃70。/。乙醇，DNA沉淀风干后，溶解于200ulTE(l/10),4。C保存备用。 用0.8%的琼脂糖电泳检测DNA样品质量。3引物设计及PCR反应iV'基因是利用图位克隆方法从江苏农业科学院选育的02428中克隆(PNAS,2008, 105(32):11436-11431 )，与籼稻和粳稻等位基因相比较，&"基因在5'端缺失136bp， 导致该基因功能丧失，与籼稻和粳稻的杂种F,不存在S5位点的育性障碍。横跨该缺 失设计PCR引物S5I36,&"基因的PCR产物为441 bp,籼稻和粳稻的S5等位基因PCR 产物为577 bp，引物设计采用Primer 5软件。S5136-For: 5' ATCAACCCATTTCCTTTCCT 3'S5136-Rev: 5' ATACGCTCGATCGGATTAAC 3'引物合成由Invitrogen公司完成。将合成的引物用ddH20稀释为10pmol/W， -20°C保存备用。以提取的DNA为模板，按下列反应体系进行PCR。PCR反应体系(25iil)为DNA 2.0^1,上游引物S5136-For0.5 下游引物S5136-Rev 0.5 10xbuffer 2.5fil, MgCl2 (5mmol/L)2p1, Taq酶0,25p1, dNTP ( 2.5 mmol/L) 1^1,纯水16.25^1。扩增条件 为94。C, 5min; 94°C , 30s， 58°C, 30s, 72°C , 30s, 35个循环；72°C,延伸10 min; l(TC,冷却10min，结束反应。PCR反应在MJPTC200热循环仪中进行，扩增产物加 入指示剂(0.25%溴酚兰、0.25% 二甲苯青FF、 本文档来自技高网...
【技术保护点】
广亲和基因Ｓ↓［５］↑［ｎ］的分子标记方法，其特征在于： 开发了可以准确鉴别广亲和基因Ｓ↓［５］↑［ｎ］基因型的共显性ＩｎＤｅｌ标记Ｓ５１３６ 上游引物：５′ＡＴＣＡＡＣＣＣＡＴＴＴＣＣＴＴＴＣＣＴ ３′ 下游引物：５′Ａ ＴＡＣＧＣＴＣＧＡＴＣＧＧＡＴＴＡＡＣ ３′ 扩增有广亲和基因Ｓ↓［５］↑［ｎ］的品种ＤＮＡ，能够扩出４４１ｂｐ的扩增片段，而不带Ｓ↓［５］↑［ｎ］的品种ＤＮＡ扩增出５７７ｂｐ片段。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨杰，仲维功，陈志德，王军，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]
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