一种检测驼背鲈的引物对、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术涉及一种检测驼背鲈的引物对、试剂盒和检测方法，其引物对序列如SEQIDNo：1和SEQIDNo：2所示。还包括含有该引物对的试剂盒及其用引物对和试剂盒的检测方法。本发明专利技术的检测方法简单、快速、特异、灵敏。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体而言，本专利技术涉及用于检测驼背鲈的引物对、试剂盒及其检测方法。
技术介绍
骑背自卢iCromileptes alti又称老鼠斑,是名贵的经济鱼类,市场需求量很大，价格特别昂贵。近年来随着人们生活水平的提高和需求的不断变化，名贵鱼类的消费发展极为迅猛，一些不法商贩频频通过错误标签、以次充好和虚假标注等手段牟取暴利，损害消费者的利益和健康，也使得食品成分、品质和质量安全等问题逐渐凸现。为保护消费者权益，需要确定产品所用鱼类的真实性和种类，建立可靠而准确的鱼类物种鉴定方法。 鱼类的物种鉴定，已从形态学方法发展到目前广泛应用的分子生物学方法。形态学方法是经典的方法，但只适用于完整形态的鱼样品，一旦进行了加工，如鱼片、鱼糜等，那些用于鉴定的特征就可能被破坏，形态学鉴定就会变得困难，也会导致结果不准确。分子生物学方法包括蛋白质方法和DNA检测方法。蛋白质方法的缺点是不适用于加工食品，因为高盐、高热、高压等常见的加工方式会导致蛋白变性，从而使分析可靠性较低。而DNA检测方法则更稳定耐热，更特异，结果也更加灵敏和准确。目前在物种鉴定领域应用最广泛的DNA检测方法包括PCR及其相关技术(如RFLP)和DNA序列分析等。PCR是通过扩增待测样品的DNA，使其能够从最初的微小数量增至足以达到检测限量的巨大数量。目前，PCR方法已广泛应用于各个基因检测领域。国内外学者对驼背鲈进行物种DNA鉴定的研究较少，国内外尚未见报道能够快速、简单、特异且灵敏地检测驼背鲈的PCR方法以及试剂盒。因此，目前需要一种能够快速、简单、特异且灵敏地检测驼背鲈的鉴定方法。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种快速、简单、特异且灵敏地检测驼背鲈的鉴定方法。为实现上述目的，提供一种检测驼背鲈的引物对，具体为所述引物对序列为SEQID No 1和SEQ ID No 2所示的序列。本专利技术还提供一种试剂盒，含有SEQ ID No 1和SEQ ID No 2所示的序列引物对的试剂盒。本专利技术保护了所述引物对和含引物对的试剂盒用于检测驼背鲈的用途。本专利技术提供了一种用于检测驼背鲈的方法，其特征在于包括用所述引物对或者含所述引物对的试剂盒进行PCR扩增的步骤。具体步骤为 从样品中提取DNA为I旲板；利用所述引物对或者含所述引物对的试剂盒中的引物对作为PCR扩增的引物，进行PCR扩增，得到扩增产物； 检测扩增产物，并作出判断。所述的PCR反应体系为25 μ L，即在O. 2 mL的PCR反应管中加入2. 5 μ L 10XPCR缓冲液，2. 5 μ L 25 mmol/L 的 MgCl2, 2. 5 μ L2. 5 mmol/L 的 dNTP，0.2 μ L 5 U/μ L 的DNA聚合酶，I μ L 10 4 11101/1的上游引物0&1匕1 μ L 10 μ mol/L的下游引物Calr，I μ L样品基因组DNA，14. 3 μ L超纯水。所述的PCR 反应条件为95 0C 5 min ；94 °C 30 s，60 °C 40 s，72 °C I min，共35个循环；72 V延伸7 min。所述的检测扩增产物并作出判断是采用电泳检测，出现275 bp左右的特异性扩增条带即判断为检出驼背鲈。本专利技术引物对是通过分析已报道的驼背鲈线粒体细胞色素氧化酶I亚基 (cytochrome oxidase subunit I，C0I)基因序列设计。本专利技术的引物对根据驼背鲈COI基因序列(Genbank序列号JF750765即SEQ IDNo 3)和其他石斑鱼 COI 序列(Genbank 序列号 JF750758、JF750759、JF750760、JF750761、JF750762、JF750763、JF750764)设计得到。使用本专利技术的引物对，能够特异、灵敏地扩增出目的片段。使用本专利技术的引物对进行检测，实施例显示，只有驼背鲈特异性产生275 bp的扩增条带，其他9种石斑鱼和其他30种鱼均未产生275 bp的扩增条带。驼背鲈与石斑鱼属的关系比较近，故选择这9种石斑鱼进行PCR扩增，以检测本专利技术方法的特异性。结果表明建立的PCR方法具有良好的特异性，可用于驼背鲈的检测。这9种石斑鱼为赤点石斑鱼{Epinephelus akaara )、云纹石斑鱼{Epinephelus moara )、掠点石斑鱼{Epinephelusfuscoguttatus)、 带石斑鱼{Epinephelus coioides)、青石斑鱼{Epinephelus awoara)、琐瑁石斑鱼 QEpinephelus quoyanus )、宽额 S卢{Promicrops lanceola tus )、斑觸棘鱼卢iPlec tropomus macula tus )、豹纹鱼思棘鱼卢 QPlec tropomus Ieopardus )。使用本专利技术的引物对进行检测，可从驼背鲈含量为0. I %的样品中成功检测出驼背鲈。具有较高的灵敏度，符合日常检测的要求。使用本专利技术的引物对进行检测，具有灵敏度高、特异性强的特点；本专利技术的PCR检测方法，具有高效、快速和敏感性高的优点。使用本专利技术的引物对进行检测，其快速、特异、灵敏、准确和简便的特点适合用于国内外市场上驼背鲈的真伪鉴别和样品中驼背鲈成分的检测等。附图说明图I为本专利技术驼背鲈PCR检测方法的特异性试验结果 图2为本专利技术驼背鲈PCR检测方法的特异性试验结果 图3为本专利技术驼背鲈PCR检测方法的特异性试验结果 图4为是本专利技术驼背鲈PCR检测方法的灵敏度试验结果图。具体实施例方式下面将结合实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限定本专利技术的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例I : I.引物对的设计根据驼背鲈COI基因序列(Genbank序列号JF750765即SEQ ID No:3)和其他石斑鱼COI序列设计得到，具体引物对序列如下SEQ ID No :1 :5’ - gCTTCTCCTTgCTTCTTCTg -3，SEQ ID No :2 :5’ - gTACAgggAgAgAAAgAAgTAg -3’。弓丨物序列由TAKARA公司合成。 2.引物对的合成和试剂盒的制备 根据上述核苷酸序列信息由TAKARA公司合成引物对。将上述合成好引物对分别配制成浓度为10 Mfflol/L的溶液作为试剂盒，备用。以下实施例所述的上游引物Calf即为SEQ ID No :1，下游引物Calr即为SEQ IDNo 2 ο3.样品基因组DNA的提取(按照QIAGEN DNeasy血液和组织DNA提取试剂盒制备样品的基因组DNA溶液) 1)取鱼的肌肉组织剪碎后，用液氮充分研磨混匀。从中取约25mg置于灭菌的I. 5 mL离心管中； 2)加入180μ ATL缓冲液和20 PL蛋白酶K，漩涡混匀，56 °C水浴约I h，并不断摇动，直至组织完全消化； 3)加入200μ AL缓冲液，漩涡混匀。再加入200 μ 无水乙本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测驼背鲈的引物对，其特征在于，所述引物对序列为SEQ？ID？No：1和SEQ？ID？No：2所示的序列。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测驼背鲈的引物对，其特征在于，所述引物对序列为SEQ ID No :1和SEQID No 2所示的序列。2.一种用于检测驼背鲈的试剂盒，其特征在于含有权利要求I所述引物对的试剂盒。3.权利要求I的引物对、权利要求2的试剂盒用于检测驼背鲈的用途。4.一种用于检测驼背鲈的方法，其特征在于包括用权利要求I的引物对或者权利要求2试剂盒中的引物对进行PCR扩增的步骤。5.权利要求4所述方法，其特征在于 从样品中提取DNA为I旲板； 利用权利要求I的引物对或者权利要求2试剂盒中的引物对作为PCR扩增的引物，进行PCR扩增，得到扩增产物； 检测扩增产物，并作出判断。6.权利要求4或5所述方法，其特征在于所述的PCR反应体系为25μ L，即在O. 2 mL的 PCR 反应管中加入 ...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈双雅，陈伟玲，王嘉鹤，张永祥，徐敦明，周昱，
申请(专利权)人：厦门出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：