本发明专利技术涉及EBV病毒的多重荧光定量PCR检测试剂盒，所述的试剂盒含有以下试剂：a、扩增Epstein-Barr病毒关键靶基因突变的特异性引物对；和b、Epstein-Barr病毒关键靶基因突变的特异性探针，所述的基因突变为EBNA-1基因编码区的P-thr、V-val和V-leu，EBNA-1基因启动子Cp、Fp和Zp，和LMP1基因XhoI-loss、30bpDeletion和Ser366Thr。本发明专利技术优点在于：能够达到准确预测高危人群鼻咽癌发病风险的目的；掌握高危人群体内的主要致癌突变，将鼻咽癌的人群筛查和人群干预结合起来；具有高灵敏度，操作快速，成本较低的优点，具有广阔的市场。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测试剂盒及其应用，具体地说,是ー种Epstein-Barr病毒的多重荧光定量PCR检测试剂盒及在鼻咽癌筛查中的应用。
技术介绍
鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma, NPC)是一种在我国南方和东南亚地区常见的恶性肿瘤，其进展性发展，稍晚常发生转移和扩散。目前鼻咽癌主要依靠放射性治疗，中晚期肿瘤病人的预后仍然很差，I期患者放疗后5年生存率可达90%，IV期患者5年生存率 仅30%，因此早期发现是提高治愈率的关键。对鼻咽癌高危人群进行血清学筛查是发现早期鼻咽癌的重要途径。Epstein-Barr病毒(EBV)是鼻咽癌(NPC)发病最重要的环境危险因素。虽然EBV流行遍布全世界，但是NPC只在华南及东南亚高发。这主要是因为EBV —些重要癌基因(如EBNAU LMPl等)发生了突变，且突变的病毒株获得了优势扩増。作为NPC筛查的标本常为血液和鼻分泌物，现有最常用技术方法为采用ELISA法检测EBV的VCA、EBNA及EA等抗原。这些现有技术的缺陷主要有两点I) ELISA法只能检测病毒含量，但不知EBV在体内的变异情况，因为不是所有EBV病毒株在体内都致癌，所以这种方法不能真实反应受检者患癌风险；2)方法是采用ELISA法检测EBV的抗原，方法不够灵敏，且检测易受多种因素的干扰。中国专利文献CN101597646A公开了ー种鼻咽癌相关基因EBNAl的早期检测试剂盒及其检测方法和应用，提供了一种鼻咽癌相关基因EBNAl的早期检测试剂盒，包括鼻咽癌相关基因EBNAl扩增用基因特异性引物、dNTP、用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液，还提供了鼻咽癌相关基因EBNAl的早期检测方法及其应用。中国专利文献CN101956014A公开了ー种用于鼻咽癌早期诊断的外周血7个基因标志物的检测试剂盒，该试剂盒包含外周血总RNA提取试剂、RT-PCR反应液、实时荧光定量RT-PCR反应液和SVM鼻咽癌诊断模型，实时荧光定量RT-PCR反应液包含引物，引物序列是7个基因标志物及内參基因GAPDH的SYBR Green荧光定量RT-PCR检测引物。所述I个基因标志物为HERC5、DLG7、PRARG、PLK1、KIF15、KLHL25和MYST4。但是关于Epstein-Barr病毒关键靶基因突变的多重荧光定量PCR检测试剂盒及其在鼻咽癌筛查中的应用目前还未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供ー种Epstein-Barr病毒的多重荧光定量PCR检测试剂盒。本专利技术的再一的目的是，提供ー种Epstein-Barr病毒的多重荧光定量PCR检测试剂盒的应用。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案是=Epstein-Barr病毒的多重荧光定量PCR检测试剂盒，所述的试剂盒含有以下试剂 a、扩增Epstein-Barr病毒关键靶基因突变的特异性引物对；和 b、Epstein-Barr病毒关键靶基因突变的特异性探针，所述的基因突变为EBNA-I基因编码区的 P-thr、V-val 和 V_leu，EBNA-I 基因启动子 Cp、Fp 和 ZpJP LMPl 基因 Xhol-loss、30bp Deletion 和 Ser366Thr ； C、不同浓度的Epstein-Barr病毒基因突变标准品系列； d、用于荧光定量PCR反应的PCR反应液(包含ROX荧光、dNTP、DNA聚合酶及其缓冲液)。所述的扩增Epstein-Barr病毒关键靶基因突变的特异性引物对为 a、EBNA-I基因编码区SEQ ID NO. 10 和 SEQ ID NO. 11 ；b、EBNA-I基因启动子SEQ ID NO. 15 和 SEQ ID NO. 16 ；c、LMPl基因 XhoI-Ioss :SEQ ID NO. 20 和 SEQ ID NO. 21，和 LMPl 基因 30bp Deletion和 Ser366Thr SEQ ID NO. 23 和 SEQ ID NO. 24。所述的Epstein-Barr病毒关键靶基因突变的特异性探针具有下列核苷酸序列 a、针对P-thr特异性探针SEQID NO. 12，针对V_val特异性探针SEQ ID NO. 13，和针对V-Ieu特异性探针SEQ ID NO. 14 ； b、针对Cp特异性探针SEQID NO. 17，针对Fp特异性探针SEQ ID NO. 18，针对Zp特异性探针 SEQ ID NO. 19 ； C、针对XhoI-Ioss特异性探针SEQ ID NO. 22，针对30bp Deletion特异性探针SEQ IDNO. 25，针对 Ser366Thr 特异性探针 SEQ ID NO. 26。为实现上述第二个目的，本专利技术采取的技术方案是所述的试剂盒在制备检测鼻咽癌疾病药物中的应用。本专利技术优点在干 1、本专利技术的试剂盒能够达到在人群中高通量筛查NPC的目的，不仅可检测EBV中癌基因的关键突变类型，还可准确检测这些关键基因突变的数量，达到准确预测高危人群鼻咽癌发病风险的目的； 2、采用本试剂盒掌握高危人群体内的主要致癌突变，今后可采用后续核酸干扰的方法对高危个体进行预防，将鼻咽癌的人群筛查和人群干预结合起来； 3、本专利技术具有高灵敏度，操作快速，成本较低的优点，具有广阔的市场，经济效益非常可观。附图说明附图I是EBNAl P-thr突变基因型荧光定量PCR扩增图。附图2是EBNAl V-val突变基因型荧光定量PCR扩增图。附图3是EBNA-I V-Ieu突变基因型荧光定量PCR扩增图。附图4是EBNA-I基因Cp启动子突变基因型荧光定量PCR扩增图。附图5是EBNA-I基因Fp启动子突变基因型荧光定量PCR扩增图。附图6是EBNA-I基因Zp启动子突变基因型荧光定量PCR扩增图。附图7是LMPl XhoI-Ioss突变基因型荧光定量PCR扩增图。具体实施例方式下面结合附图对本专利技术提供的具体实施方式作详细说明。实施例I I.检测的癌基因及突变类型 EBV导致NPC发生与EBV的一些潜伏期抗原有关，如latent membrane protein (LMP)和EBV associated nuclear antigen-1 (EBNA-1)。大量研究在NPC患者中重点分析这些病毒基因的突变，如中山大学附属肿瘤医院调查了四会市17个城镇312680人，共发现NPC患者60人；并在国内外首次进行了华南地区EBV全序列測定的工作，发现EBNA基因变异与鼻咽癌相关。该项目组发现在鼻咽癌组织中只存在缬氨酸型(V-val)EBNA1 (检出率98. 1%)，而在外周血淋巴细胞和唾液除可检测到EBNAl V-valタト,还能检测到丙氨酸型(P_ala)和 苏氨酸型(P-thr)EBNAl。并且发现在外周血淋巴细胞和唾液中，几乎所有V-val突变病毒株均与P-ala病毒株混合感染。因而本专利技术从检出效率的角度出发，在外周血和唾液能检测到的两种基因型P-ala及P-thr中，重点检测P_thr。为使本专利技术今后能扩展到预测EBV相关的其他肿瘤发病风险，本专利技术还检测亮氨酸型(V-Ieu) EBNAl。曾木圣等报道华南NPC患者本文档来自技高网...
【技术保护点】
Epstein？Barr病毒的多重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有以下试剂：a、扩增Epstein？Barr病毒关键靶基因突变的特异性引物对；和b、Epstein？Barr病毒关键靶基因突变的特异性探针，所述的基因突变为EBNA？1基因编码区的P？thr、V？val和V？leu，EBNA？1基因启动子Cp、Fp和Zp，和LMP1基因XhoI？loss、30bp？Deletion和Ser366Thr；c、不同浓度的Epstein？Barr病毒基因突变标准品系列；d、用于荧光定量PCR反应的PCR反应液（包含ROX荧光、dNTP、DNA聚合酶及其缓冲液）。
【技术特征摘要】
1.Epstein-Barr病毒的多重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有以下试剂 a、扩增Epstein-Barr病毒关键靶基因突变的特异性引物对；和 b、Epstein-Barr病毒关键靶基因突变的特异性探针，所述的基因突变为EBNA-I基因编码区的 P-thr、V-val 和 V_leu，EBNA-I 基因启动子 Cp、Fp 和 ZpJP LMPl 基因 Xhol-loss、30bp Deletion 和 Ser366Thr ； C、不同浓度的Epstein-Barr病毒基因突变标准品系列； d、用于荧光定量PCR反应的PCR反应液(包含ROX荧光、dNTP、DNA聚合酶及其缓冲液)。2.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所述的扩增Epstein-Barr病毒关键革巴基因突变的特异性引物对为 a、EBNA-I基因编码区SEQ ID NO. 10 和 SEQ ID NO. 11 ； b、EBNA-I基因启动子SEQ ID NO. 15 和 SEQ ID NO. 16 ；c、LMPl基因 ...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘斌，
申请(专利权)人：广州市第十二人民医院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。