本发明专利技术属于免疫分析技术领域，具体涉及一种利用标识蛋白分析鉴定哺乳动物Y精子分型的方法。利用免疫荧光、免疫印迹和流式细胞仪分析，确定了在Y精子中表达和定位于Y精子顶体部分的基因蛋白TSPY。本发明专利技术的蛋白TSPY可在哺乳动物X和Y精子的分离中作为Y精子标识抗原蛋白应用。该Y精子标识蛋白TSPY可在哺乳动物精液中X和Y精子分离中作为Y精子标识抗原蛋白，所述的哺乳动物包括牛、羊、猪、兔、马等，但不包括人类。本发明专利技术的Y精子标识蛋白用于分离X和Y精子具有准确、快速、简便、成本低、设备简单、对精子伤害小等优势，适于动物生产中应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于免疫分析
，具体涉及一种利用标识蛋白分析鉴定哺乳动物Y精子分型的方法。所述的哺乳动物包括牛、羊、猪、兔、马等，但不包括人。
技术介绍
在畜牧业生产中，新生仔畜的性别比例已经成为影响畜牧业经济效益的重要因素。例如，在奶牛养殖中，人们更希望母畜在新生仔畜中占更高的比例。此外，性别选择可以避免伴性疾病在畜群中传播。所以在不影响母畜受胎率的情况下，实现对怀孕母畜后代性别的控制对于畜牧业至关重要。然而，目前得到广泛应用的高效而便利的性别控制方法还不断研究和完善中，其中利用免疫学原理和抗原抗体特异免疫反应技术进行X和Y精子的分离的策略之一。目前，应用于X/Y精子分离的方法包括：电泳法、白蛋白柱分离法、Percoll密度梯度离心法、免疫法和流式细胞仪分离法。其中分离效果最稳定、纯度最高的是流式细胞分离技术，流式细胞仪可识别因X和Y精子DNA含量差异而携带不同的荧光染色信号，从而分离X和Y精子，其分离纯度可达90％，在奶牛业中得到一定的应用。虽然流式细胞法在分选速度和纯度上都有所提高，但该方法因设备高昂、成本高、分离对精子造成伤害、购买知识产权等缺点或不足限制了其在生产中的应用。所以，根据抗原和抗体特异结合的原理的免疫法分离X和Y精子，具有高特异性、高效率、低成本的优势，应用前景广阔。如果能够找到X和Y精子中特异表达或显著表达差异的精子膜蛋白，即X精子或Y精子标识蛋白，则可根据抗原抗体特异性结合建立免疫分离X和Y精液技术，有望以较低的成本、快速地实现对X和Y精子的分离，有可能满足生产中对性控精液的需要。X精子或Y精子标识蛋白用于分离性别控制X和Y精子的原理：将X精子或Y精子标识蛋白作为抗原，利用其相应的抗体，进行抗原与抗体特异性结合的免疫反应，这种抗原抗体结合的特异性是指抗原表位与抗体超变区结合的特异性，是由两者在化学结构和空间构型上呈互补关系所决定的，故而两者结合高效且特异。
技术实现思路
本专利技术目的在于克服现有技术的缺陷，建立一种利用标识蛋白分析鉴定哺乳动物Y精子分型的方法，本专利技术利用免疫荧光、免疫印记和流式细胞仪等技术分析和鉴定出了在动物Y精子中表达和定位于Y精子顶体部分的基因蛋白TSPY(testis-specificproteinYencoded，睾丸特异性蛋白)，提供了一种可用于哺乳动物(包括牛、羊、猪、兔、马等，但不包括人类)性控X和Y精子分离的Y精子标识抗原蛋白TSPY，该蛋白可用于Y精子的生物标识物，用于哺乳动物性别控制X和Y精子的分离，为哺乳动物性别控制、改变哺乳动物性别比例和提高生产效率提供技术支持。本专利技术的技术方案如下所述：申请人提供了一种利用标识蛋白分析鉴定哺乳动物Y精子分型的方法。所述的动物Y精子分型方法包括检测试剂盒、抗体-流式细胞仪、抗体-磁珠或抗体直接作用精子等的应用。所述应用的哺乳动物，包括牛、猪、马、兔，但不不包括人类。本专利技术的Y精子的标识蛋白TSPY(testis-specificproteinYencoded，睾丸特异性蛋白)位于Y精子顶体部分，TSPY标识蛋白的抗体能特异性识别和结合含标识蛋白TSPY的Y精子，而不能与不含标识蛋白TSPY的X精子结合，根据抗体是否与精子结合而达到分离X和Y精子的目的。TSPY可以作为一个重要的Y精子的标识蛋白，可将Y精子从哺乳动物精液中分离出来，分别获得X精子和Y精子的性别控制精液。为以后免疫法分离X和Y精子的研究提供了新的思路，具有重大的理论意义和潜在的使用价值。具体地，本专利技术的应用步骤如下所述：申请人提供了一种利用标识蛋白分析鉴定哺乳动物Y精子分型的方法，包括下述步骤利用免疫荧光技术首次证实了TSPY基因蛋白在精子顶体部分表达且在Y精子中表达，是Y精子标识基因蛋白。为了进一步分析TSPY蛋白在精子中表达和定位，利用免疫印记技术分析和确定了TSPY基因蛋白在动物Y精子中表达和定位于Y精子顶体部分，利用TSPY抗体采用流式细胞仪技术分离出了Y精子和X精子，Y精子纯度至少可达82.20％。并用建立的基因SRY-PCR技术验证了分离出的X精子和Y精子的纯度，得到结果稳定可靠。本专利技术分离精子具有快速、准确、简便、成本低、设备简单等优势，适于在性控动物大规模生产中应用。本专利技术为哺乳动物性别控制技术的研发和性别分化机理的研究提供了基础，具有重要的理论意义和潜在的应用价值。1、利用免疫荧光方法检测TSPY蛋白在牛精子顶体部分中表达取适量优化荷斯坦奶牛精液加入磷酸盐缓冲液(PBS)，使精子浓度达到105个/ml，再取100ul处理过的精液涂于经多聚赖氨酸处理在过的载玻片上，通风晾置数分钟；用浓度为0.5％TritonX100/PBS通透5min；再用浓度为5％的牛血清白蛋白(BSA)/PBS封闭30min；在样品表面均匀涂抹上用浓度为1％的体积比为1:100稀释的BSA/PBS稀释TSPY蛋白抗体，4℃孵育过夜，用浓度为1％的BSA/PBS洗5min/3次；用体积比为1:200的1％BSA/PBS稀释液的荧光二抗羊抗兔Cy3)稀释液，37℃孵育1小时，用PBS洗5min/3次；加入DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)染核10min；加抗荧光淬灭剂封片，置于荧光显微镜下观察；检测TSPY蛋白在荷斯坦奶牛精子中的表达和定位；2、利用WesternBlotting检测TSPY蛋白在牛Y精子中的表达(1)分别提取荷斯坦奶牛商业性控X精液和Y精液的蛋白，进行WesternBlot分析，实验验证TSPY蛋白在牛X和Y精子中的差异化表达，并利用ImageJ软件进行相关的统计学分析；(2)提取商业化的荷斯坦奶牛X精液、Y精液中总蛋白，利用WesternBlotting检测TSPY蛋白抗体与TSPY蛋白结合情况，用ImageJ扫描WesternBlot结果灰度值，检测X精子中存在少量的TSPY蛋白表达，得到包含TSPY蛋白的Y精子的标识蛋白；(3)以TSPY蛋白为Y精子标识蛋白，利用TSPY蛋白抗体分离X精子和Y精子，用流式细胞仪分析分离出的X精子和Y精子的纯度(4)将荷斯坦奶牛精子与TSPY抗体以体积比为1：100混合，在37℃孵育40min，再与体积比为1：200的FITC羊抗兔荧光二抗在37℃孵育40min，洗涤后利用流式细胞仪分选出TSPY阳性精子，该精子即为Y精子，和TSPY阴性精子，该精子即为X精子；(5)利用流式细胞仪分别检测分离出的X精子和Y精子的纯度，将分离出的X精子和Y精子分别再放入流式细胞仪中，分析它们与TSPY蛋白抗体结合的阳性比率；其中上述TSPY蛋白的Y精子的标识蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；3、利用基因SRY-PCR检测分离出的X精子和Y精子的纯度(1)分别提取分离Y精子和分离X精子以及来自商业化的同一头荷斯坦奶牛X精液、Y精液和普通精液基因组DNA，用半定量SRY-PCR检测Y精子比例，检测分离出的X精子和Y精子的纯度，分别扩增各样本的SRY基因序列(登陆号为ID:280931)，用ImageJ软件统计分析扩增结果的琼脂糖凝胶电泳图的灰度值；(2)合成登陆号为ID:280931的SRY基因的扩增引物对，该引物对的序列如下所示：上游引物CATTCATCGTGTGGTCTCGCGA本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用标识蛋白分析鉴定哺乳动物Y精子分型的方法，其特征在于，包括下述步骤：(1)利用免疫荧光方法检测TSPY蛋白在牛精子顶体部分中表达取适量荷斯坦奶牛精液加入磷酸盐缓冲液(PBS)，使精子浓度达到105个/ml，再取100ul荷斯坦奶牛精液涂于经多聚赖氨酸处理过的载玻片上，通风晾置数分钟；用浓度为0.5％TritonX100/PBS缓冲液通透5min；再用浓度为5％的牛血清白蛋白(BSA)/PBS缓冲液封闭30min；在样品表面均匀涂抹上浓度为1％的体积比为1:100稀释的BSA/PBS稀释的TSPY蛋白抗体，4℃孵育过夜，用浓度为1％的BSA/PBS洗5min/3次；用体积比为1:200的1％BSA/PBS稀释液的荧光二抗羊抗兔Cy3稀释液，37℃孵育1小时，用PBS洗5min/3次；加入DAPI染核10min；加抗荧光淬灭剂封片，置于荧光显微镜下观察；检测TSPY蛋白在荷斯坦奶牛精子中的表达和定位；(2)利用Western Blotting检测TSPY蛋白在牛Y精子中的表达1)分别提取荷斯坦奶牛商业性控X精液和Y精液的蛋白，进行Western Blot分析，实验验证TSPY蛋白在奶牛X和Y精子中的差异化表达，并利用Image J软件进行相关的统计学分析；2)提取商业化的荷斯坦奶牛X精液和Y精液中的总蛋白，利用Western Blotting检测TSPY蛋白抗体与TSPY蛋白结合情况，用Image J扫描Western Blot结果灰度值，检测X精子中存在少量的TSPY蛋白表达，得到包含TSPY蛋白的Y精子的标识蛋白；3)以TSPY蛋白为Y精子标识蛋白，利用TSPY蛋白抗体分离X精子和Y精子，用流式细胞仪分析分离出的X精子和Y精子的纯度；4)将荷斯坦奶牛精子与TSPY抗体以体积比为1：100混合，在37℃孵育40min，再与体积比为1：200的FITC羊抗兔荧光二抗在37℃孵育40min，洗涤后利用流式细胞仪分选出TSPY阳性精子，该精子即为Y精子，和TSPY阴性精子，该精子即为X精子；5)利用流式细胞仪分别检测分离出的X精子和Y精子的纯度，将分离出的X精子和Y精子分别再放入流式细胞仪中，分析它们与TSPY蛋白抗体结合的阳性比率；其中上述步骤中所述的TSPY蛋白的Y精子的标识蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；(3)利用基因SRY‑PCR检测分离出的X精子和Y精子的纯度1)分别提取分离Y精子和分离X精子以及来自商业化的同一头荷斯坦奶牛的X精液、Y精液和普通精液基因组DNA，用半定量SRY‑PCR检测Y精子比例，检测分离出的X精子和Y精子的纯度，分别扩增各样本的SRY基因序列，所述的SRY基因的登陆号为ID:280931，用Image J软件统计分析扩增结果的琼脂糖凝胶电泳图的灰度值；2)合成所述的SRY基因的扩增引物对，该引物对的序列如下所示：上游引物：CATTCATCGTGTGGTCTCGCGA，下游引物：GCCTTCCGACGAGGTCGATACT‑3；3)提取5个样本DNA进行PCR扩增，利用琼脂糖凝胶电泳分析所有样品，以登陆号为ID:281181的GAPDH基因作为内参基因，合成如下所述的引物对，其引物对的序列如下所示：上游引物：CTCACATTCCTAAGTCCGCTTT，下游引物：GTCCCTGAGCTTTGTCCTGTC 3。...
【技术特征摘要】
1.一种利用标识蛋白分析鉴定哺乳动物Y精子分型的方法，其特征在于，包括下述步骤：(1)利用免疫荧光方法检测TSPY蛋白在牛精子顶体部分中表达取适量荷斯坦奶牛精液加入磷酸盐缓冲液(PBS)，使精子浓度达到105个/ml，再取100ul荷斯坦奶牛精液涂于经多聚赖氨酸处理过的载玻片上，通风晾置数分钟；用浓度为0.5％TritonX100/PBS缓冲液通透5min；再用浓度为5％的牛血清白蛋白(BSA)/PBS缓冲液封闭30min；在样品表面均匀涂抹上浓度为1％的体积比为1:100稀释的BSA/PBS稀释的TSPY蛋白抗体，4℃孵育过夜，用浓度为1％的BSA/PBS洗5min/3次；用体积比为1:200的1％BSA/PBS稀释液的荧光二抗羊抗兔Cy3稀释液，37℃孵育1小时，用PBS洗5min/3次；加入DAPI染核10min；加抗荧光淬灭剂封片，置于荧光显微镜下观察；检测TSPY蛋白在荷斯坦奶牛精子中的表达和定位；(2)利用WesternBlotting检测TSPY蛋白在牛Y精子中的表达1)分别提取荷斯坦奶牛商业性控X精液和Y精液的蛋白，进行WesternBlot分析，实验验证TSPY蛋白在奶牛X和Y精子中的差异化表达，并利用ImageJ软件进行相关的统计学分析；2)提取商业化的荷斯坦奶牛X精液和Y精液中的总蛋白，利用WesternBlotting检测TSPY蛋白抗体与TSPY蛋白结合情况，用ImageJ扫描WesternBlot结果灰度值，检测X精子中存在少量的TSPY蛋白表达，得到包含TSPY蛋白的Y精子的标识蛋白；3)以TSPY蛋白为Y精子标识蛋白，利用TSPY蛋白抗体分离X精子和Y精子，用流式细胞仪分析分离出的X精子和Y精子的纯度；4)将荷斯坦奶牛精子与TSPY抗体以体积比为1：100混合，在37℃孵育40min...
【专利技术属性】
技术研发人员：张淑君，刘方，周浩，上官爱哨，杨利国，南良康，梁秋曼，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。