荧光定量PCR引物探针和试剂盒及检测三种芽孢杆菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种荧光定量PCR引物探针组和试剂盒及检测三种芽孢杆菌的方法，包括具有SEQ ID NO.1‑6所示核苷酸序列的引物，以及，含有SEQ ID NO.7‑9所示核苷酸序列的探针。本发明专利技术还提供了一种荧光定量PCR检测三种芽孢杆菌的试剂盒，所述试剂盒包括本发明专利技术所述的荧光定量PCR引物探针组和Hotstar DNA聚合酶。通过上述技术方案本发明专利技术显著地提高了对三种芽孢杆菌同时进行检测的敏感性、特异性和简便性。

Fluorescent quantitative PCR primer probe and kit and method for detecting three kinds of Bacillus

The invention discloses a method of fluorescence quantitative PCR primer probe sets and kit and the detection of three Bacillus species, including primer, with SEQ ID NO.1 6 nucleotide sequence represented by SEQ and ID NO.7 probe containing 9 nucleotide sequences shown in the. The invention also provides a kit for fluorescence quantitative PCR detection of three species of Bacillus, the kit of the invention comprises the fluorescent quantitative PCR primers and Hotstar polymerase DNA group. The technical proposal of the invention can obviously improve the sensitivity, specificity and simplicity of simultaneous detection of three Bacillus species.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体地，涉及荧光定量PCR引物探针组和试剂盒及检测三种芽孢杆菌的方法。
技术介绍
芽孢杆菌属是一类重要的食源性致病菌，非常容易引起食品和化妆品的污染，进而感染人类引起发病。芽孢杆菌属中的蜡样芽孢杆菌组对食品安全污染防控意义重大，其中炭疽芽孢杆菌是最重要的致病菌，能够引起严重的肺炭疽病、肠炭疽病、皮肤炭疽病等，且病人具有强烈的传染性。除了接触感染之外，通过进食被该菌污染的肉类也可以引起发病。蜡样芽孢杆菌是该组第二位的致病菌，其引起的食物中毒具有普遍性的特点，主要是因为蜡样芽孢杆菌广泛存在于自然界的土壤、灰尘、污水、动植物体中，容易在生产、加工和烹饪以及剩饭存放诸多环节进入食品，引起食物中毒。其中米饭是蜡样芽孢杆菌最容易繁殖的食物，全世界范围内诸多的食物中毒事件都是由此类食物引发的。苏云金芽孢杆菌是一种昆虫病原菌，但随着生物农药的应用普遍，陆续进入人类的食物中，在食物中毒原因判断过程中容易引起误导，所以，确定炭疽芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌需要排除苏云金芽孢杆菌的干扰。针对三种细菌的标准实验室检测方法，《炭疽诊断标准》(WS283-2008)通过镜检革兰氏阳性大杆菌、分离培养细菌以及血清抗体4倍增高等手段诊断炭疽感染；美国FDA、国际化标准组织ISO和国内标准均要求采用分离、培养、计数和生化鉴定的方法对蜡样芽孢杆菌进行检测。苏云金芽孢杆菌与其他芽孢杆菌鉴定的主要依据是，苏云金芽孢杆菌在特定条件下产生伴孢晶体。其他的检测方法包括分别对三种细菌进行等温PCR、荧光定量PCR、免疫层析等技术手段的分析。芽孢杆菌污染的检测是食品安全监测和食物中毒事件分析过程中的重要工作之一，炭疽芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌是芽孢杆菌污染中最具有代表性和防控意义的致病菌，而苏云金芽孢杆菌是风险评估中需要排除的干扰因素。因此，同时筛查和检测炭疽芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌在食品安全风险评估中具有重要的意义。目前检测三种细菌的荧光定量PCR方法、等温扩增PCR方法、液相芯片技术等只是针对单一目标的检测鉴定技术，操作时需要逐个目标开展检测，耗费人力、试剂和时间，并且需要对每一次检测做好质量控制，保证三个检测结果的均一性。以免疫层析技术为代表的快速检测技术，则存在检测敏感度不够，工艺复杂，无法对多个目标在同一反应体系内检测等不足之处。现在还没有针对蜡样芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌三种细菌采用多重荧光定量PCR同时鉴定其种属的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是解决蜡样芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌三种细菌同时检测与鉴定的问题，提供一种检测蜡样芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌的荧光定量PCR引物探针组和试剂盒，同时准确鉴定蜡样芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌，建立一种基于荧光定量PCR平台的三重PCR检测方法。为达到以上目的，本专利技术提供多重PCR检测三种芽孢杆菌用引物探针组，其中，包括具有SEQ ID NO.1-6所示核苷酸序列的引物，以及，含有SEQ ID NO.7-9所示核苷酸序列的探针。其中，所述引物探针组还包括具有SEQ ID NO.10-11所示核苷酸序列的引物，以及，含有SEQ ID NO.12所示核苷酸序列的探针。本专利技术还提供了一种三重荧光定量PCR检测三种芽孢杆菌的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：(1)提取待测样本的总DNA；(2)以所述总DNA为模板，并使用本专利技术所述的引物探针组，进行三重荧光定量PCR反应；(3)收集检测通道荧光信号，得到检测结果；在空白对照、阳性对照和阳性内对照成立的情况下，在每个荧光检测通道中：a)若样本有S型扩增，且CT值小于35，则判定样本为阳性；b)若样本有S型扩增，且CT值小于40并大于等于35，则判定为不确定样本，需重新提取核酸后进行复检；若复检的样本仍有S型扩增，且CT值小于40，则判定样本为阳性，否则为阴性；c)若样本无明显S型扩增曲线，但报告有CT值，则判定为非特异性扩增。本专利技术的一个方面还提供了一种三重荧光定量PCR检测三种芽孢杆菌的试剂盒，所述试剂盒包括本专利技术所述的引物探针组。本专利技术建立的蜡样芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌三重荧光定量PCR检测引物探针组、方法和试剂盒能够实现食品中重要芽孢杆菌种的快速筛查与鉴别，避免血清学、病原培养学等方法的繁琐操作，达到如下的检测效果：(一)多重检测本专利技术所建立的检测方法能够在一次PCR反应中同时筛查蜡样芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌，快速简便的获得致病相关芽孢杆菌属的病原种类，节省时间、人力和试剂成本。(二)灵敏度高本专利技术基于荧光定量PCR检测平台建立了三重PCR检测方法，创造性的采用了两种不同的退火延伸温度，这与一般荧光定量PCR技术要求不同。本专利技术采用先低后高的退火延伸温度，保证扩增反应特异性的同时提高了富集模板的效率，最终产生明显的灵敏度升高效果，最低可以实现每个反应检测目标<10个拷贝。(三)特异性高本专利技术所建立的检测方法的特异性主要体现在一整套引物探针的特异性，所有引物都经过blast比对分析，具有高度的保守性和特异性，不仅在本专利技术中检测目标能够相互区分，而且还能与其他种属相近、生存环境相同的细菌区别开，这包括蕈状芽孢杆菌、韦氏芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希氏菌、阪崎肠杆菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、霍乱弧菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、嗜水气单胞菌等，证明检测方法具有高度的特异性，能够将非检测目标准确分辨出来。(四)预防假阴性结果体系中添加的阳性内对照，可以有效的提示假阴性检测结果。本专利技术为食品中蜡样芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌的快速筛查提供了完备的解决方案，能实现食品安全日常监测、食物中毒事件发生后和疫情暴发后的常见致病性芽孢菌的筛查，为食品安全风险评估和食物中毒事件的合理恰当处置提供可靠的实验室依据。本专利技术的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。附图说明附图是用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本专利技术，但并不构成对本专利技术的限制。在附图中：图1为试剂盒荧光定量PCR检测实际样本的扩增曲线。模板为三种芽孢杆菌的混合模板。扩增曲线编号1的为蜡样芽孢杆菌(FAM)、编号2为炭疽芽孢杆菌(HEX)、编号3为苏云金芽胞杆菌(CY5)、编号4为阳性内对照(ROX)。图2为荧光定量PCR多重引物探针特异性的验证，其中模板为14种无关病原体、蜡样芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌、苏云金芽胞杆菌三种阳性对照及阳性内对照质粒。结果显示，除了阳性内对照以及三个目标的阳性对照有扩增外，无其他扩增信号。扩增曲线编号1的为蜡样芽孢杆菌阳性对照(FAM)、编号2为炭疽芽孢杆菌阳性对照(HEX)、编号3为苏云金芽胞杆菌阳性对照(CY5)、编号4为阳性内对照(ROX)。具体实施方式以下结合附图对本专利技术的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限制本专利技术。本专利技术的一种实施方式提供了一种多重PCR检测三种芽孢杆菌用引物探针组，包括具有SEQ ID NO.1-6所示核苷酸序列的引物，以及，含有SEQ ID NO.7本文档来自技高网...

【技术保护点】
多重PCR检测三种芽孢杆菌用引物探针组，其特征在于，包括具有SEQ ID NO.1‑6所示核苷酸序列的引物，以及，含有SEQ ID NO.7‑9所示核苷酸序列的探针。

【技术特征摘要】
1.多重PCR检测三种芽孢杆菌用引物探针组，其特征在于，包括具有SEQ ID NO.1-6所示核苷酸序列的引物，以及，含有SEQ ID NO.7-9所示核苷酸序列的探针。2.根据权利要求1所述的引物探针组，其中，还包括具有SEQ ID NO.10-11所示核苷酸序列的引物，以及，含有SEQ ID NO.12所示核苷酸序列的探针。3.一种三重荧光定量PCR检测三种芽孢杆菌的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：(1)提取待测样本的总DNA；(2)以所述总DNA为模板，并使用权利要求1或2所述的引物探针组，进行三重荧光定量PCR反应；(3)收集检测通道荧光信号，得到检测结果；在空白对照、阳性对照和阳性内对照成立的情况下，在每个荧光检测通道中：a)若样本有S型扩增，且CT值小于35，则判定样本为阳性；b)若样本有S型扩增，且CT值小于40并大于等于35，则判定为不确定样本，需重新提取核酸后进...

【专利技术属性】
技术研发人员：王雷，林笑冬，张志强，
申请(专利权)人：北京卓诚惠生生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11